本文關(guān)鍵詞：歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗規(guī)模化制備及其免疫研究

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome,PRRS)是一種感染率高的豬傳染病,嚴(yán)重影響著世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)。PRRS病毒分為歐洲型PRRSV(基因1型)以及美洲型PRRSV(基因2型),二者基因同源性相差40%左右。豬繁殖與呼吸綜合征臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙,斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率增加。世界上很多國(guó)家一直應(yīng)用弱毒疫苗和滅活疫苗來預(yù)防PRRSV。但是,弱毒疫苗的應(yīng)用,易造成病毒返祖,滅活疫苗則免疫原性一般很難有效的預(yù)防PRRSV。因此針對(duì)具有基因多樣性特點(diǎn)的PRRSV,需要研發(fā)出一種安全有效的PRRS疫苗。我國(guó)PRRSV主要流行毒株為美洲型高致病性毒株,但近幾年在我國(guó)多個(gè)省份相繼分離到了歐洲型PRRS毒株,歐洲型PRRSV的出現(xiàn)應(yīng)該引起我們的關(guān)注。我國(guó)目前市面上的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為美洲型,美洲型的PRRS疫苗對(duì)歐洲型PRRSV基本無交叉免疫保護(hù)性,因此需要研發(fā)出一種安全有效的歐洲型PRRS疫苗。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。主要分為PCV-1和PCV-2兩種血清型。加拿大1991年在世界范圍內(nèi)首次報(bào)道PMWS,到目前為止該病現(xiàn)已波及世界上很多國(guó)家,是被全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一,在中國(guó)PCV2在豬群中流行也十分嚴(yán)重。因此,研發(fā)一種安全有效的疫苗是解決PCV2流行問題的關(guān)鍵。研究目的:本研究開展了歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗的制備和免疫研究,通過利用微載體生物反應(yīng)器技術(shù)制備實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗,并通過豬體免疫實(shí)驗(yàn)對(duì)其免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究?jī)?nèi)容:1.篩選出增殖能力強(qiáng)的種子細(xì)胞及種毒,建立種子細(xì)胞庫(kù)及種病毒庫(kù)。2.通過細(xì)胞條件、感染條件、生產(chǎn)參數(shù)進(jìn)行重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化。3.通過微載體生物反應(yīng)器技術(shù)建立分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)、灌注式培養(yǎng)三種生產(chǎn)工藝,進(jìn)行歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗的制備。4.利用微載體生物反應(yīng)器制備的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗進(jìn)行豬體免疫研究。研究方法:1.種子細(xì)胞庫(kù)及種毒庫(kù)建立通過細(xì)胞傳代、細(xì)胞感染、滴度測(cè)定等方法,篩選出安全無致瘤性的bhk-21細(xì)胞及適合生產(chǎn)的歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒rvtt-orf2-euo3o5毒株,建立種子細(xì)胞庫(kù)及種毒庫(kù)。2.重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化通過細(xì)胞條件優(yōu)化和感染條件優(yōu)化確定一套可用于細(xì)胞增殖和病毒擴(kuò)增的生產(chǎn)控制條件。再通過研究溫度、ph、轉(zhuǎn)速等不同的調(diào)控參數(shù)在培養(yǎng)過程中對(duì)細(xì)胞和病毒收益的影響,進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)控參數(shù),為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖提供有效的參數(shù)。3.歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒候選疫苗制備通過結(jié)合重組痘苗病毒疫苗優(yōu)化后的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行生物反應(yīng)器生產(chǎn)工藝流程的制定,并通過生產(chǎn)過程中葡萄糖和乳酸中間的關(guān)系對(duì)細(xì)胞增殖的影響選出最佳生產(chǎn)工藝。并對(duì)生物反應(yīng)器所制備疫苗進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),疫苗品質(zhì)是否符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》第三部的要求。4.歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒候選疫苗豬體免疫研究通過利用生物反應(yīng)器制備的以歐洲型prrsv經(jīng)典株lv株的orf3和orf5基因以及pcv2的orf2基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的重組痘苗病毒(rvtt-orf2-eu-o3o5)疫苗進(jìn)行豬體免疫實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其各項(xiàng)免疫指標(biāo),分析重組痘苗病毒疫苗的免疫效果。研究結(jié)果:1.通過致瘤性實(shí)驗(yàn),證明了bhk-21種細(xì)胞的安全、純凈;通過種子細(xì)胞、種毒的產(chǎn)毒比較,驗(yàn)證了種細(xì)胞的增殖及產(chǎn)毒優(yōu)勢(shì),達(dá)到了預(yù)期的目的;通過pcr鑒定、wb鑒定,證明了歐洲型prrsv、pcv2重組痘苗病毒,可以表達(dá)外源基因,形態(tài)上與天然痘苗病毒無差異;通過篩選,成功建立了種子細(xì)胞庫(kù)和種毒庫(kù),凍存種子細(xì)胞16株,凍存種毒10株。2.通過細(xì)胞條件優(yōu)化,最終確定以10%血清(hyclone)濃度的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞階段的培養(yǎng)基;通過感染條件優(yōu)化,最終確定以0.1MOI的感染劑量和2%血清濃度的維持液作為病毒感染階段的感染條件;通過生產(chǎn)參數(shù)優(yōu)化,最終確定細(xì)胞增殖階段參數(shù):溫度為37℃、pH=7.3及M=80r/min。感染階段參數(shù):溫度為35℃、pH=7.1及M=40r/min。3.通過利用微載體生物反應(yīng)器技術(shù)建立了分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)和灌注式培養(yǎng)三種生產(chǎn)方式;根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝物質(zhì)對(duì)細(xì)胞增殖的影響,確定灌注式培養(yǎng)是最適合疫苗制備的生產(chǎn)工藝;本實(shí)驗(yàn)制備的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗,質(zhì)量符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》第三部疫苗標(biāo)準(zhǔn)。4.通過豬體免疫實(shí)驗(yàn),歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組,均能在35d能夠有效的誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答,且中和抗體效價(jià)可達(dá)1:18.表明重組痘病毒疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答;歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組細(xì)胞因子,T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等結(jié)果顯著高于野毒及PBS對(duì)照組,表明重組痘病毒疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答;攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,疫苗免疫組體溫顯著低于對(duì)照組,且體溫均低于40℃無發(fā)熱臨床癥狀表現(xiàn)。病毒載量和病理切片結(jié)果表明在病毒入侵時(shí)重組痘苗病毒疫苗可以提供良好保護(hù)性。研究結(jié)論:1.成功篩選出種子細(xì)胞和種毒,并建立了種子細(xì)胞庫(kù)及種病毒庫(kù)。2.通過細(xì)胞條件優(yōu)化、病毒條件優(yōu)化及生產(chǎn)參數(shù)優(yōu)化,確定生產(chǎn)過程中最優(yōu)收益條件及參數(shù)。3.建立了三種生產(chǎn)工藝,通過培養(yǎng)中各物質(zhì)之間消耗代謝關(guān)系,確定灌注式生產(chǎn)工藝為生產(chǎn)方式進(jìn)行疫苗制備。4.通過疫苗豬體免疫實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并在病毒入侵機(jī)體時(shí)提供良好的保護(hù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 張仁舟;楊松濤;夏咸柱;;重組痘苗病毒載體研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年01期

2 鄧永鴻;;重組痘苗病毒對(duì)癌癥可能有免疫和治療作用[J];生物技術(shù)通報(bào);1988年04期

3 王宏宇;徐一鳴;盛媛;李一權(quán);閻富龍;趙權(quán);李霄;金寧一;;四聯(lián)重組痘苗病毒的構(gòu)建及篩選[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年09期

4 徐文忠，陳萍，杜念興;基因重組痘苗病毒在雞胚中的增殖與表達(dá)[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1994年02期

5 佟明華,金寧一,毛春生,秦翠麗,顧萬鈞,王秀清,郭志儒,郭軍慶,楊同書,殷震;不同啟動(dòng)子對(duì)重組痘苗病毒表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白基因的影響[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);1997年04期

6 樂牧;;重組痘苗病毒作為疫苗抗原活毒載體前途廣闊[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;1986年02期

7 徐文忠,杜念興,李光地,汪垣;生長(zhǎng)抑素與乙肝表面抗原融合基因重組痘苗病毒的構(gòu)建及其表達(dá)[J];南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1992年03期

8 李國(guó)華;李貞;喬軍;陳創(chuàng)夫;才學(xué)鵬;孟慶玲;丁波;;鏈球菌GapC基因重組痘苗病毒的構(gòu)建及篩選與鑒定[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年05期

9 王秀清,金寧一,田梅,毛春生,李體遠(yuǎn),王宏偉,蘇忠蘭,殷震;HIV-2gag基因在重組痘苗病毒中的表達(dá)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);1997年06期

10 楊霞,毛春生,盧中華,陳麗穎,張紅英,李樹文,武愛梅;表達(dá)MDVgB基因重組痘苗病毒的構(gòu)建及保護(hù)性研究[J];河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 盛媛;李霄;金寧一;;重組痘苗病毒的構(gòu)建與表達(dá)[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會(huì)論文集[C];2012年

2 王宇航;李霄;金寧一;;三聯(lián)重組痘苗病毒天壇株的探索性研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會(huì)論文集[C];2012年

3 劉昊;魯會(huì)軍;劉振江;靖杰;陸飛;劉燕瑜;任靜強(qiáng);金寧一;;表達(dá)基孔肯雅病毒E基因的重組痘苗病毒構(gòu)建[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第十二次人獸共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第六屆第十四次教學(xué)專業(yè)委員會(huì)論文集[C];2012年

4 房有榮;閻輝;;以GFP-Zeocin為篩選標(biāo)志的重組痘苗病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建[A];2011年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分會(huì)、醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)分會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

5 樓覺人;張群;朱琳;;插入結(jié)核抗原基因的重組痘苗病毒對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染恒河猴模型的免疫保護(hù)性研究[A];第五次全國(guó)免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

6 樓覺人;張群;朱琳;;插入結(jié)核抗原基因的重組痘苗病毒對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染恒河猴模型的免疫保護(hù)性研究[A];2011中國(guó)生物制品年會(huì)暨第十一次全國(guó)生物制品學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

7 郭斐;陸柔劍;孫朝暉;阮力;;非復(fù)制重組痘苗病毒中共表達(dá)的細(xì)胞因子(IL-5、IL-6)可增強(qiáng)重組病毒的免疫效果[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第三次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉昊;乙型腦炎病毒分子流行病學(xué)、診斷及重組疫苗研究[D];吉林大學(xué);2013年

2 趙莉;HPV16、18、58型多價(jià)重組痘苗病毒構(gòu)建及免疫效果研究[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2008年

3 李清秀;表達(dá)HIV-1的重組痘苗病毒的構(gòu)建及免疫策略對(duì)含有蒙脫石的DNA疫苗免疫作用的影響[D];吉林大學(xué);2004年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 韓繼成;歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗規(guī)模化制備及其免疫研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

2 肖朋朋;乙型腦炎重組痘苗病毒疫苗安全性評(píng)價(jià)研究[D];吉林大學(xué);2015年

3 王平興;MERS-CoV S重組痘苗病毒免疫原性評(píng)價(jià)及血清抗體檢測(cè)方法初步探索[D];中國(guó)疾病預(yù)防控制中心;2015年

4 謝芳藝;Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白2A重組痘苗病毒轉(zhuǎn)染DCs及特異性CTL的體外誘導(dǎo)[D];南京醫(yī)科大學(xué);2001年

5 李媛;牛流行熱病毒JB76H株G蛋白及牛白細(xì)胞介素-2基因在重組痘苗病毒中的表達(dá)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

6 張麗霞;EBV-LMP2重組痘苗病毒免疫效果研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2014年

7 戴凱凡;表達(dá)HIV-Ⅰ多價(jià)野生基因和合成基因重組痘苗病毒疫苗株的構(gòu)建及與DNA疫苗聯(lián)合免疫效果的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

8 王鳳娟;JEV多表位基因重組痘苗病毒安卡拉株（rMVA-mep）及其免疫效果評(píng)價(jià)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

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