發(fā)布時間：2017-11-02 06:31

  本文關(guān)鍵詞：水貂CpG ODN的篩選及其對水貂偽狂犬滅活疫苗的免疫增強作用

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【摘要】：人工合成的含非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(synthetic oligodeoxynucleotides containing CpG motifs,CpG ODN)是備受人們關(guān)注的一種新型疫苗佐劑。它能夠與多種免疫細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Toll樣受體9(TLR-9)結(jié)合,引發(fā)機體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答,通過促進Th1型免疫反應(yīng)和分泌促炎因子來非特異性的增強適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強度,在機體抵抗病原入侵和抗腫瘤等方面起到免疫增強劑的作用。CpG ODN作為疫苗佐劑具有高效、安全、可與其他佐劑聯(lián)合使用的優(yōu)點,但其免疫刺激活性復(fù)雜多變,具有種屬特異性,這種特異性與其自身的堿基序列和分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。目前人們已相繼發(fā)現(xiàn)了針對人、豬、牛、雞、犬、貓等多種動物有效的CpG ODN,其作為免疫佐劑在人用疫苗領(lǐng)域的研究較為深入,但在獸用疫苗尤其是毛皮動物方面的研究開展的較為緩慢,國內(nèi)外均未報道過對毛皮動物水貂具有免疫刺激活性的CpG ODN。本研究參考與水貂親緣關(guān)系較近的犬的有效CpG基序,設(shè)計合成了25條不同的CpG ODN,通過體外刺激分離培養(yǎng)的水貂外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),從中篩選出能夠有效刺激水貂PBMC增殖的CpG ODN,并對CpG ODN刺激水貂PBMC培養(yǎng)上清的抗病毒活性進行研究,獲得了對水貂具有免疫刺激活性的CpG-23,并將其作為偽狂犬滅活疫苗佐劑在水貂體內(nèi)進行了驗證。首先通過對篩選條件的摸索,發(fā)現(xiàn)水貂外周血單個核細胞數(shù)為4×105個/孔,CpG ODN工作濃度為10μg/mL,37℃、5%CO2條件下刺激48 h時,以MTS比色法檢測水貂PBMC增殖最明顯。用此方法進行CpG ODN刺激水貂PBMC增殖能力檢測,篩選出能夠顯著刺激水貂PBMC增殖的CpG-2、CpG-7、CpG-10、CpG-21、Cp G-23和CpG-24(p0.01),其中CpG-23、CpG-24的刺激指數(shù)(SI)分別高達14.874和14.261。進一步用CpG-23、CpG-24刺激水貂PBMC培養(yǎng)上清與偽狂犬病毒(PRV)共同作用于貂肺(ML)細胞,發(fā)現(xiàn)CpG-23刺激水貂PBMC培養(yǎng)上清能夠一定程度的抑制PRV對ML細胞的感染,表現(xiàn)出一定的抗病毒活性。再分別用20μg、40μg和80μg的CpG-23與偽狂犬滅活疫苗聯(lián)合免疫水貂,分析CpG-23對偽狂犬滅活疫苗免疫效果的影響。將25只2月齡健康水貂隨機分成五組,分別為PBS組、疫苗對照組、20μg聯(lián)合免疫組、40μg聯(lián)合免疫組、80μg聯(lián)合免疫組。首免后第14 d進行同劑量的二次免疫,在首次免疫后7、14、21和28 d分別采血,分離血清,檢測血清中PRV中和抗體滴度。結(jié)果顯示,不同劑量的CpG-23聯(lián)合偽狂犬滅活疫苗免疫組的中和抗體效價均高于單獨疫苗免疫組,且中和抗體水平隨CpG-23使用劑量的增加而升高,表明CpG-23能夠有效地輔助偽狂犬滅活疫苗在水貂體內(nèi)產(chǎn)生更高水平的中和抗體。綜上所述,本研究篩選出了能夠在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出對水貂具有良好免疫刺激活性的CpG-23,該新型CpG ODN有望作為一種新型疫苗佐劑應(yīng)用于水貂疫苗,從而為CpG ODN在水貂疫苗中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ),提供實驗依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CpG ODN 水貂 淋巴細胞增殖反應(yīng) 偽狂犬滅活疫苗 中和抗體
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.92
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 前言9-11
• 第一篇 文獻綜述11-20
• 第一章 CpG ODN免疫佐劑效應(yīng)研究進展11-17
• 1.1 CpG ODN的發(fā)現(xiàn)11-12
• 1.2 CpG ODN的種類及其結(jié)構(gòu)、功能特征12-13
• 1.3 CpG ODN免疫佐劑效應(yīng)的作用機制13-14
• 1.4 CpG ODN對不同畜禽的免疫增強作用14-15
• 1.5 CpG ODN作為疫苗佐劑使用的安全性15
• 1.6 展望15-17
• 第二章 水貂偽狂犬病17-20
• 2.1 病原學(xué)17
• 2.2 流行病學(xué)特點17-18
• 2.3 臨床癥狀和病理變化18
• 2.4 診斷18
• 2.5 危害與防控18-20
• 第二篇 研究內(nèi)容20-43
• 第一章 Cp G ODN刺激水貂PBMC增殖能力的檢測20-32
• 1.1 材料和方法20-23
• 1.2 結(jié)果23-30
• 1.3 討論30-31
• 1.4 小結(jié)31-32
• 第二章 CpG ODN刺激水貂PBMC培養(yǎng)上清抗病毒作用的研究32-36
• 2.1 材料和方法32-33
• 2.2 結(jié)果33-34
• 2.3 討論34-35
• 2.4 小結(jié)35-36
• 第三章 CpG ODN對水貂偽狂犬滅活疫苗的免疫增強作用36-43
• 3.1 材料和方法36-38
• 3.2 結(jié)果38-41
• 3.3 討論41-42
• 3.4 小結(jié)42-43
• 結(jié)論43-44
• 參考文獻44-48
• 作者簡介48-49
• 致謝49

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本文編號：1130415