本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒感染報(bào)告細(xì)胞系和豬圓環(huán)病毒2型敏感細(xì)胞系的建立

  更多相關(guān)文章： 豬瘟病毒 綠色熒光蛋白 豬圓環(huán)病毒 白介素-2 病毒增殖

【摘要】：豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸性傳染病,每年給我國養(yǎng)豬業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。盡管病毒分離培養(yǎng)是病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn),但該方法耗時(shí)過長;分子生物學(xué)方法雖然靈敏、耗時(shí)短,但容易出現(xiàn)假陽性。病毒感染報(bào)告細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是檢測靈敏度高,且可一次分析多個(gè)樣本,既可用于病毒的檢測,也可用于病毒的分離培養(yǎng),還可以用于高通量篩選抗病毒藥物。本研究構(gòu)建了CSFV感染報(bào)告細(xì)胞系。首先,在EGFP與淬滅肽中間插入可被CSFVNS3蛋白酶特異識(shí)別并切割的保守NS4A/4B序列,構(gòu)建出報(bào)告質(zhì)粒;然后,將報(bào)告質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,獲得CSFV報(bào)告細(xì)胞系PK-15-CSFV-EGFP;該細(xì)胞系在感染CSFV時(shí),與EGFP融合表達(dá)的NS4A/4B序列被NS3蛋白酶識(shí)別并切割,從而使淬滅肽與EGFP肽分離,EGFP肽構(gòu)象重排形成成熟的發(fā)光團(tuán)結(jié)構(gòu),最終發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。對(duì)PK-15-CSFV-EGFP細(xì)胞系進(jìn)行發(fā)光檢測、靈敏度檢測、特異性檢測、熒光強(qiáng)度和病毒拷貝數(shù)相關(guān)性分析和不同細(xì)胞系增殖CSFV效果分析。結(jié)果表明,在熒光顯微鏡下,細(xì)胞系PK-15-CSFV-EGFP只有在感染CSFV后才能夠檢測到明顯的綠色熒光,而無病毒感染或感染其它豬源病毒時(shí)不發(fā)出綠色熒光;在48 hpi時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng),且細(xì)胞熒光強(qiáng)度與CSFV病毒量呈正相關(guān)關(guān)系;報(bào)告細(xì)胞系與q PCR靈敏度一致,均優(yōu)于RT-PCR;CSFV在報(bào)告細(xì)胞系中的增殖能力與其在ST、PK-15細(xì)胞中沒有明顯的區(qū)別。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制效率較低,一般都在106-107TCID50/m L左右。PCV DNA復(fù)制通常開始于細(xì)胞有絲分裂后期,其復(fù)制依賴細(xì)胞分裂S期合成的相關(guān)酶。內(nèi)源性和外源性的IL-2能直接刺激各類上皮細(xì)胞的增殖(由G1期進(jìn)入S期),且在培養(yǎng)液中加入IL-2,可顯著增強(qiáng)PCV2的復(fù)制。基于此原理,本研究構(gòu)建了豬圓環(huán)病毒敏感細(xì)胞系。首先,從新鮮血液中分離得到淋巴細(xì)胞,在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Con A誘導(dǎo)IL-2細(xì)胞因子的表達(dá),并克隆豬源IL-2基因;然后,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)豬源IL-2的細(xì)胞系(PK-15-IL-2)。對(duì)PK-15-IL-2進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,PK-15-IL-2能夠明顯促進(jìn)PCV2復(fù)制,連續(xù)攻毒后,PCV2拷貝數(shù)可到1×1010/m L,病毒TCID50為109-109.5/m L。本研究構(gòu)建的豬瘟病毒感染報(bào)告細(xì)胞系和豬圓環(huán)病毒敏感細(xì)胞系,對(duì)病毒的相關(guān)研究及疾病預(yù)防具有重要意義,在臨床檢測、科學(xué)研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 綠色熒光蛋白 豬圓環(huán)病毒 白介素-2 病毒增殖
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文縮寫詞表10-11
• 前言11-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-23
• 第1章 豬瘟病毒及檢測方法研究進(jìn)展12-18
• 1.1 豬瘟病毒基因組結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2 豬瘟病毒常規(guī)的檢測方法13-17
• 1.3 構(gòu)建豬瘟病毒報(bào)告細(xì)胞系的意義17-18
• 第2章 豬圓環(huán)病毒2型增殖方法的研究進(jìn)展18-23
• 2.1 PCV基因組特征18
• 2.2 PCV2的增殖方法18-21
• 2.3 構(gòu)建豬圓環(huán)病毒敏感細(xì)胞系的意義21-23
• 第二篇 研究內(nèi)容23-64
• 第1章 豬瘟病毒感染報(bào)告細(xì)胞系的建立23-48
• 1.1 材料24-26
• 1.2 方法26-37
• 1.3 結(jié)果37-46
• 1.4 討論46-47
• 1.5 小結(jié)47-48
• 第2章 PCV2敏感細(xì)胞系的建立48-64
• 2.1 材料48-50
• 2.2 方法50-57
• 2.3 結(jié)果57-62
• 2.4 討論62-63
• 2.5 小結(jié)63-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 作者簡介及攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)成果73-75
• 導(dǎo)師簡介75-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉坤;蘭鄒然;姜平;;豬瘟病毒分子生物學(xué)及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年10期

2 王雪玲;劉鐵龍;;豬瘟病毒基因結(jié)構(gòu)及診斷的研究進(jìn)展[J];養(yǎng)殖技術(shù)顧問;2011年02期

3 王向鵬;張興娟;孫元;李娜;賀番;常天明;李宏宇;楊增岐;仇華吉;;六種檢測豬瘟病毒方法的比較[J];微生物學(xué)報(bào);2010年08期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊鑫;PCV2體外培養(yǎng)特性的研究及HMGCR對(duì)PCV2復(fù)制的影響[D];吉林大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 徐燕;熒光素酶作為報(bào)告基因的丙型肝炎病毒細(xì)胞感染系統(tǒng)的建立和應(yīng)用[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

2 張朝紅;豬瘟四種實(shí)驗(yàn)室診斷方法的比較研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

，

本文編號(hào)：1123588