本文關(guān)鍵詞：水貂腸炎病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及膠體金試紙條的研制

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【摘要】：水貂病毒性腸炎(Mink viral enteritis)是由水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)引起的一種急性傳染病。自然條件下主要特性為劇烈腹瀉,幼齡水貂具有較高的發(fā)病率和死亡率。隨著世界毛皮動物飼養(yǎng)業(yè)的快速發(fā)展,水貂病毒性腸炎已經(jīng)成為危害水貂養(yǎng)殖業(yè)三大疫病之一,給全世界養(yǎng)貂業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。免疫膠體金層析技術(shù)(Gold immunochromatography assay,GICA)是免疫層析技術(shù)、膠體金標記技術(shù)及免疫反應的結(jié)合體。膠體金是一種常用的標記技術(shù),以膠體金作為標志物應用抗原、抗體檢測的一種新型的檢測方法,具有簡單快速、結(jié)果清晰,可通過肉眼觀察、靈敏度高、無污染和攜帶方便等優(yōu)點。因此該技術(shù)得到了迅速發(fā)展,在獸醫(yī)學領域應用也越來越多。本研究采用競爭法建立檢測MEV膠體金試紙條,檸檬酸三鈉還原法制備20 nm的膠體金顆粒與抗MEV單克隆抗體合成金標探針。純化的MEV VP2蛋白包被在NC膜上作為檢測線(T線),羊抗鼠IgG包被在NC膜上作為質(zhì)控線(C線),組裝成膠體金層析試紙條。根據(jù)水貂腸炎病毒MEVB毒株,設計特異性引物擴增MEV VP2結(jié)構(gòu)蛋白基因獲得1 773 bp基因片段;將該基因片段連接到克隆載體上,驗證正確后定向連接到原核表達載體PET-30a,構(gòu)建MEV VP2基因原核表達重組質(zhì)粒PET-30a-VP2。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3),重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定正確后進行誘導表達。IPTG誘導后進行SDS-PAGE和Western blotting分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白在37?C,誘導劑IPTG終濃度為1.0 mmol/L條件下良好表達,鑒定該重組MEV VP2蛋白以包涵體的形式存在,大小約為70 KD,用鎳柱純化后獲得較純的融合蛋白。采用蔗糖密度梯度超速離心法純化MEVB細胞培養(yǎng)物。經(jīng)純化的MEVB毒株免疫BALB/c小鼠,制備脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,經(jīng)間接ELISA方法的篩選,獲得6株能穩(wěn)定分泌抗MEV單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分別命名為4、6、8、10、13、14。該6株單克隆抗體分別進行了腹水效價測定,結(jié)果為單抗4和13抗體效價為1.28×105,單抗6和14抗體效價為2.56×105,單抗8和10抗體效價為5.12×105;特異性試驗鑒定該6株單克隆抗體能與犬細小病毒(CPV)及水貂腸炎病毒(MEV)呈陽性反應,但不與犬瘟熱病毒(CDV)、水貂阿留申病毒(AMDV)及犬腺病毒(CAV)發(fā)生反應;經(jīng)亞型鑒定,其中單抗4、10為IgG2b亞型、單抗6為IgG1亞型,單抗8、13、14為IgG2a亞型;間接免疫熒光鑒定該6株單克隆抗體均能使接毒的F81細胞產(chǎn)生綠色熒光;免疫印跡試驗結(jié)果顯示該6株單克隆抗體可在約70 KD處出現(xiàn)特異性反應條帶。本試驗為MEV的深入研究、快速診斷方法的建立奠定了基礎。采用檸檬酸三鈉還原法制備出20 nm膠體金顆粒,與抗MEV單克隆抗體10偶聯(lián)形成金標探針。優(yōu)化最佳試紙條各項參數(shù),將MEV VP2蛋白以0.8 mg/mL的濃度包被于NC膜上作為檢測線(T線),將羊抗鼠IgG以1 mg/mL濃度包被于NC膜上作為質(zhì)控線(C線)。該膠體金檢測試紙條的敏感性為1:64。該試紙條檢測MEV和CPV樣品為陽性結(jié)果,而對CDV、CAV和AMDV等相關(guān)病毒樣品檢測均為陰性結(jié)果,說明該試紙條特異性良好。與CPV膠體金試紙條方法符合率可達到94.1%。在4?C和25?C條件下可以保存6個月其敏感性和特異性沒有明顯的變化。本研究成功的建立檢測MEV膠體金試紙條,為早期診斷、預防和控制MEV具有重要的現(xiàn)實意義。
【關(guān)鍵詞】：水貂腸炎病毒 VP2蛋白 單克隆抗體 免疫膠體金試紙條
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 第一章 文獻綜述13-22
• 1.1 水貂腸炎病毒13-18
• 1.1.1 生物學特性13-14
• 1.1.2 基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 1.1.3 遺傳進化15-16
• 1.1.4 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體16-17
• 1.1.5 疫苗研究17-18
• 1.1.6 診斷方法18
• 1.2 免疫膠體金層析技術(shù)18-20
• 1.2.1 免疫膠體金技術(shù)簡介18-19
• 1.2.2 膠體金技術(shù)的優(yōu)點及不足19
• 1.2.3 膠體金免疫層析技術(shù)的應用19-20
• 1.3 研究目的和意義20-22
• 第二章 水貂腸炎病毒VP2基因原核表達及鑒定22-32
• 2.1 試驗材料22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒基因組的提取22-23
• 2.2.2 VP2基因的克隆23-24
• 2.2.3 表達載體的構(gòu)建與鑒定24-25
• 2.2.4 原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導表達25
• 2.2.5 重組蛋白最佳表達條件的篩選25
• 2.2.6 重組蛋白的變性25-26
• 2.2.7 重組蛋白的純化26
• 2.2.8 SDS-PAGE分析26
• 2.2.9 重組蛋白的Western blotting鑒定26
• 2.3 結(jié)果26-30
• 2.3.1 MEV VP2基因的擴增26-27
• 2.3.2 重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定27
• 2.3.3 重組克隆質(zhì)粒測序鑒定27
• 2.3.4 重組表達質(zhì)粒酶切鑒定27-28
• 2.3.5 重組表達質(zhì)粒測序鑒定28
• 2.3.6 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析28
• 2.3.7 優(yōu)化目的蛋白可溶性表達28-30
• 2.3.8 重組蛋白Western-blotting鑒定30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 水貂腸炎病毒單克隆抗體的制備32-41
• 3.1 材料32
• 3.1.1 種毒、動物與細胞系32
• 3.1.2 主要試劑和耗材32
• 3.2 方法32-37
• 3.2.1 抗原的制備32-33
• 3.2.2 動物免疫33
• 3.2.3 間接ELISA法檢測血清效價33-34
• 3.2.4 雜交瘤細胞株的制備34-35
• 3.2.5 陽性雜交瘤細胞篩選方法的建立35
• 3.2.6 陽性雜交瘤細胞的亞克�。ㄓ邢尴♂尫ǎ�35
• 3.2.7 McAb大量制備35
• 3.2.8 McAb腹水純化35-36
• 3.2.9 McAb鑒定36-37
• 3.3 結(jié)果37-39
• 3.3.1 抗原的純化37
• 3.3.2 間接ELISA方法的建立37
• 3.3.3 雜交瘤細胞的融合和篩選37
• 3.3.4 單克隆抗體的特性鑒定37-39
• 3.4 討論39-40
• 3.4.1 免疫抗原的制備39
• 3.4.2 免疫動物的選擇39
• 3.4.3 免疫程序的確定39
• 3.4.4 雜交瘤細胞篩選39
• 3.4.5 雜交瘤細胞亞克隆39-40
• 3.4.6 腹水的制備及純化40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 水貂腸炎病毒膠體金快速檢測試紙條研制41-51
• 4.1 試驗材料41
• 4.2 方法41-44
• 4.2.1 單克隆抗體預處理41
• 4.2.2 玻璃器皿酸化和硅化處理41-42
• 4.2.3 20 nm膠體金溶液的制備42
• 4.2.4 膠體金溶液的質(zhì)量鑒定42
• 4.2.5 免疫膠體金探針制備及其鑒定42-43
• 4.2.6 膠體金試紙條的制備43
• 4.2.7 膠體金檢測原理及結(jié)果判斷43-44
• 4.2.8 試紙條特異性試驗44
• 4.2.9 試紙條靈敏度試驗44
• 4.2.10 試紙條穩(wěn)定性試驗44
• 4.2.11 膠體金試紙條初步應用44
• 4.3 結(jié)果44-49
• 4.3.1 膠體金溶液的制備及鑒定44-45
• 4.3.2 膠體金與抗體結(jié)合的最佳pH值確定45-46
• 4.3.3 膠體金與抗體結(jié)合的最佳濃度確定46
• 4.3.4 膠體金探針的鑒定46-47
• 4.3.5 硝酸纖維素膜（NC膜）的選擇47
• 4.3.6 膠體金試紙條的組裝和結(jié)果的判定47-48
• 4.3.7 膠體金試紙條性能試驗48-49
• 4.3.8 膠體金試紙條初步應用49
• 4.4 討論49-50
• 4.4.1 膠體金的制備49
• 4.4.2 免疫膠體金探針的制備49-50
• 4.4.3 制備膠體金試紙條耗材的選擇50
• 4.5 小結(jié)50-51
• 第五章 全文結(jié)論51-52
• 參考文獻52-58
• 附錄58-64
• 致謝64-65
• 作者簡歷65

【參考文獻】

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本文編號：1122778