本文關鍵詞：寵物源腸桿菌中16S rRNA甲基化酶基因的流行特征及其分子傳播機制研究

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【摘要】：氨基糖苷類藥物是最早被發(fā)現(xiàn)并投入到臨床應用中的抗生素之一,盡管其重要性曾一度由于一些副作用較少的廣譜抗菌藥的推出而有所削弱,時至今日,隨著多重耐藥細菌感染率的急劇升高,氨基糖甙類抗生素作為屈指可數的可用治療選擇之一,重新獲得了人們的廣泛關注。然而,也正因為氨基糖苷類藥物的廣泛應用,近些年來,國內外關于細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥情況日趨嚴重的報道日漸增多,可使細菌對其產生耐藥性的機制種類眾多,其中以產生16S rRNA甲基化酶這種機制所導致的耐藥程度最高(通常MIC512mg/L),它可介導對大多數的臨床重要氨基糖苷類,如阿貝卡星,慶大霉素,妥布霉素和阿米卡星等藥物的耐藥,并且可以通過質粒、轉座子、整合子等可移動元件在不同菌種和物種間進行傳播。寵物作為人類最親密的伙伴,它們和人類健康的相互關聯(lián)性不言自明,本文旨在了解我國寵物臨床中16S r RNA甲基化酶基因流行性,進一步研究其遺傳特征和傳播機制,為獸醫(yī)臨床上合理利用氨基糖苷類藥物并延緩其耐藥發(fā)展速度以及減小耐藥的程度打下理論基礎,同時希望能以此為依據來促進有效遏制寵物源16S rRNA甲基化酶基因向人類傳播的措施的制定,對解決由此引發(fā)的人類的公共衛(wèi)生問題起到一定的協(xié)助作用。1、寵物源腸桿菌16S rRNA甲基化酶基因流行情況本研究以從廣東省多個動物醫(yī)院在2008、2009、2010、2012年間收集的381株腸桿菌(大腸桿菌343株,肺炎克雷伯菌30株,奇異變形桿菌6株,陰溝腸桿菌2株)為研究對象,用含有慶大霉素和阿米卡星的藥板初步篩選出具有耐藥表型的菌株77株,通過PCR以及測序的方法檢測16S rRNA甲基化酶基因(armA,rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,rmtE,rmtF,rmtG和npmA),分析不同分離時間腸桿菌的耐藥狀況以及16S rRNA甲基化酶基因的流行情況。結果發(fā)現(xiàn):在381株受試腸桿菌中,61(16.01%,61/381)株攜帶有rmtB基因,4(1.05%,4/381)株攜帶armA基因,2(0.52%,2/381)株同時攜帶rmtB、armA兩種基因,未檢出其它16S rRNA甲基化酶基因。采用瓊脂二倍稀釋法檢測了77株對阿米卡星和慶大霉素有耐藥表型的菌株對獸醫(yī)臨床常用幾類抗菌藥物:氨基糖苷類、β-內酰胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、四環(huán)素類和磺胺類的14種抗菌藥的敏感性。統(tǒng)計結果可知,這些腸桿菌對四環(huán)素、慶大霉素、磺胺甲VA唑/甲氧芐啶、氨芐西林、卡那霉素耐藥率達90%以上,對頭孢噻肟、諾氟沙星、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、氯霉素、鏈霉素、阿米卡星、新霉素的耐藥率在50%~90%之間;對安普霉素耐藥的細菌比重則低于50%。耐藥率最高的前五種抗生素分別是四環(huán)素(98.70%)、氨芐西林(97.40%)、磺胺甲VA唑/甲氧芐啶(96.10%)、慶大霉素(94.81%)和卡那霉素(94.81%)。77株腸桿菌產生耐藥率最低的三種藥物分別是安普霉素(41.56%)、氟苯尼考(53.25%)和頭孢噻肟(55.84%)。對剩下的6種抗菌藥物耐藥率范圍在70.13%至89.61%之間。這些數據充分說明,寵物源產16S rRNA甲基化酶的腸桿菌多重耐藥情況十分嚴重。2、16S rRNA甲基化酶基因的傳播機制運用脈沖場凝膠電泳(pulsedfield gel electrophoresis,PFGE)、接合轉移實驗、接合子質粒限制性內切酶片段長度多態(tài)性分析(RFLP)以及S1-PFGE和Southern blot等方法從垂直傳播和水平傳播兩方面來研究16S rRNA甲基化酶基因的傳播機制。PFGE結果表明16S rRNA甲基化酶陽性大腸桿菌之間的親緣關系較遠,而分離自同一寵物醫(yī)院的肺炎克雷伯菌株的PFGE分型相似則提示存在菌株克隆傳播現(xiàn)象。通過接合轉移實驗證明了16S rRNA甲基化酶基因的可轉移性,且在部分菌株中blaCTX-M能隨rmtB一同轉移到受體菌中。在大腸桿菌中,rmtB位于60kb~194kb左右的大小不同的IncF33或IncF2型質粒上,在肺炎克雷伯菌中,rmtB均位于~97kb的IncF33的質粒上。對接合子質粒進行EcoRI酶切,發(fā)現(xiàn)部分具有相同復制子分型的質粒酶切條帶相同或相似,有的酶切譜型相似的質粒分別來自大腸桿菌和肺炎克雷伯菌,說明攜帶16S rRNA甲基化酶基因的質粒可能存在菌種間的傳播,而IncF型質粒是促進16S rRNA甲基化酶耐藥基因在寵物源菌株間水平傳播、快速擴散的主要載體。在廣州寵物源腸桿菌中,16S r RNA甲基化酶基因的存在比較普遍,且以rmtB基因型為主,armA基因型偶發(fā)。本研究中的大腸桿菌16S rRNA甲基化酶陽性菌中rmtB基因位于~60kb至~194kb的IncF型接合性質粒上,且存在部分的質粒在菌種間傳播的現(xiàn)象;垂直克隆傳播和水平傳播共同造成了16S rRNA甲基化酶基因在肺炎克雷伯菌中的流行。rmtB陽性菌中廣泛存在CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶,并能與rmtB基因一起進行接合傳播,介導細菌同時對氨基糖苷類和β-內酰胺類藥物的耐藥性�，F(xiàn)如今,寵物社會地位的提高使得人類和他們的寵物之間有了更頻繁而密切的身體接觸(例如,通過共享生活空間)并創(chuàng)造了人類和寵物交換微生物的機會,此外,抗菌藥物的使用增加了對微生物的選擇性壓力,使得耐藥性迅速發(fā)展。
【關鍵詞】：寵物 腸桿菌 16S rRNA甲基化酶 質粒
【學位授予單位】：華南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-18
• 1.1 細菌耐藥機制簡介12-15
• 1.2 氨基糖苷類藥物耐藥性及 16S rRNA甲基化酶的發(fā)現(xiàn)歷程15-17
• 1.3 16S rRNA甲基化酶特征及流行現(xiàn)狀17-18
• 2 材料與方法18-41
• 2.1 材料18-23
• 2.1.1 受試菌株18
• 2.1.2 培養(yǎng)基18-19
• 2.1.3 主要試劑19
• 2.1.4 主要溶液的配制19-22
• 2.1.5 主要儀器與設備22
• 2.1.6 藥物22-23
• 2.2 方法23-41
• 2.2.1 細菌的復蘇、鑒定與保存23-24
• 2.2.2 耐藥表型的篩選24
• 2.2.3 16S rRNA甲基化酶基因的檢測24-25
• 2.2.4 16S rRNA甲基化酶陽性菌對14種抗菌藥的敏感性實驗25-26
• 2.2.5 脈沖場凝膠電泳（PFGE）26-29
• 2.2.6 接合轉移29-30
• 2.2.7 接合子ESBLs基因檢測及鑒定30-32
• 2.2.8 接合子質粒復制子分型32-34
• 2.2.9 質粒抽提34-36
• 2.2.10 接合子質粒的酶切分析36
• 2.2.11 S1-PFGE36-39
• 2.2.12 Southern雜交39-41
• 3 結果與分析41-53
• 3.1 細菌的復蘇和鑒定結果41-42
• 3.2 阿米卡星-慶大霉素耐藥菌株初步篩選42
• 3.3 腸桿菌 16S rRNA甲基化酶基因的檢測結果42-44
• 3.4 藥敏性測試結果44
• 3.5 PFGE結果44-46
• 3.6 接合轉移實驗結果46-50
• 3.6.1 篩選接合子的藥物濃度46
• 3.6.2 接合實驗結果46
• 3.6.3 接合子 16S rRNA甲基化酶基因的PCR檢測結果46-47
• 3.6.4 接合子Eric-PCR檢測結果47
• 3.6.5 接合子及原菌株的MIC比較47
• 3.6.6 接合子復制子分型結果47-48
• 3.6.7 接合子質粒的酶切分析48-49
• 3.6.8 接合子bla_(TEM-1)，，bla_(CTX-M)基因檢測49-50
• 3.7 S1-PFGE和Southern雜交結果50-53
• 4 討論53-58
• 4.1 寵物源腸桿菌中 16S rRNA甲基化酶的流行情況及其介導的耐藥特征53-55
• 4.2 16S rRNA甲基化酶基因和 β-內酰胺酶基因的相關性55-56
• 4.3 16S rRNA甲基化酶基因的傳播機制研究56-58
• 全文結論58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻60-65

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

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本文編號：1117884