本文關(guān)鍵詞：板藍(lán)根顆粒及黃芪多糖粉調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫力和降低豬血液中PRRS殘留毒核酸載量的研究

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【摘要】：豬藍(lán)耳病即豬繁殖與呼吸綜合征(pocrin reoductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬藍(lán)耳病毒引起的一種以妊娠母豬流產(chǎn)、各種年齡豬(特別是仔豬)呼吸障礙和大量死亡為特征的高度傳染性疾病。PRRSV會在豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)中大量復(fù)制,導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生免疫調(diào)節(jié)紊亂,引起其他疾病的繼發(fā)感染。目前我國主要通過疫苗免疫來預(yù)防PRRS,藍(lán)耳疫苗現(xiàn)市面上主要有兩種,一種為PRRS滅活苗；一種為PRRS弱毒苗(經(jīng)典毒株或高致病性毒株)。弱毒苗免疫效果較好,所以運(yùn)用較為廣泛,但弱毒苗本身存在散毒危險(xiǎn),會在豬體內(nèi)存在殘留毒。因此尋求一種既能夠使用免疫效果較好的藍(lán)耳弱毒苗又能一定程度上減輕甚至凈化藍(lán)耳弱毒苗在豬體內(nèi)的殘留毒的方法尤為重要。1黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的研究。目的：研究不同劑量的板藍(lán)根顆粒、黃芪多糖粉對小鼠免疫功能中的巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。方法：選取27只小鼠隨機(jī)分為9組,每組3只小鼠。第1-8組的小鼠分別腹腔注射4種不同濃度的板藍(lán)根顆粒、黃芪多糖粉溶液,對照組注射生理鹽水,每天1次,連續(xù)4d,第8天腹腔注射可溶性淀粉,產(chǎn)生異源性吞噬,誘導(dǎo)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞,第10d注入5%雞紅細(xì)胞1ml,讓小鼠自由活動(dòng)30min后處死小鼠吸取腹腔液于載玻片上,37℃溫箱中孵育后瑞式染色鏡檢,測定腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的變化。結(jié)果：兩種藥物均能增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能；板藍(lán)根顆粒在20mg/ml、黃芪多糖粉在30mg/ml對小鼠的效果最好,與對照組差異極顯著(P0.01)。2熒光定量RT-PCR檢測PRRSV核酸殘留毒方法建立本試驗(yàn)通過對比分析PRRSV ORF7基因序列,在其保守區(qū)設(shè)計(jì)1對引物來人工合成靶基因,經(jīng)過擴(kuò)增得到的靶基因長度為162bp,條帶清晰,擴(kuò)增效果達(dá)到預(yù)期。將靶基因純化回收,通過連接轉(zhuǎn)化,制備重組質(zhì)粒pMD19-T-PRRSV,利用PCR方法進(jìn)行初步鑒定,在確定靶基因成功轉(zhuǎn)入DH5α后再進(jìn)行測序鑒定,而測序結(jié)果與NCBI上登錄的PRRSV ORF7基因的同源性達(dá)100%,說明成功克隆了靶基因,同時(shí)將制備的重組質(zhì)粒抽提后測定其濃度作為熒光定量RT-PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)簡并引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。同時(shí)通過優(yōu)化簡并引物濃度和退火溫度確定該方法的最佳反應(yīng)條件,成功建立了關(guān)于PRRSV的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法,簡并引物的設(shè)計(jì)更便于不同地區(qū)之間毒株的鑒定。經(jīng)過特異性、靈敏性以及重復(fù)性試驗(yàn),該方法可以特異性的檢測到pMD19-T-PRRSV,可檢測到的陽性質(zhì)粒模板的最低拷貝數(shù)為1.66×101 copies,陽性質(zhì)粒模板在組內(nèi)的變異系數(shù)均小于2%,表明該方法的特異性好,靈敏度高。為后期藥物試驗(yàn)監(jiān)控豬血液中PRRSV核酸載量變化量奠定了基礎(chǔ)。3黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒降低母豬血液中PRRSV殘留毒(或疫苗毒)的研究目的：通過黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒的飼喂,檢測帶毒母豬血液中PRRSV殘留毒(或疫苗毒)的變化,初步揭示黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒降低豬血液中PRRS殘留毒(或疫苗毒)的能力,為生產(chǎn)實(shí)際上保證豬群健康提供參考和幫助,以利于黃芪多糖粉和板藍(lán)根顆粒類中草藥添加劑的開發(fā)和應(yīng)用。方法：選取21頭經(jīng)檢測帶有PRRS殘留毒(或疫苗毒)的后備母豬,隨機(jī)分為3組,并于每組中各加入3頭不帶毒的健康母豬,即對照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組。對照組飼喂普通飼料,試驗(yàn)1組使用黃芪多糖粉拌料飼喂,試驗(yàn)2組使用板藍(lán)根顆粒拌料飼喂。3個(gè)組試驗(yàn)?zāi)肛i分開飼喂,飼喂周期為兩個(gè)月,每十天進(jìn)行一次采血通過建立的熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測各組母豬血液中PRRS殘留毒(或疫苗毒)核酸載量。結(jié)果表明：兩種藥物均能在一定程度上保護(hù)健康母豬免受PRRSV感染。而對于已經(jīng)帶毒的母豬,板藍(lán)根顆粒能有效的降低其血液中PRRSV核酸的載量,幫助母豬凈化血液中的PRRSV殘留毒,降低母豬的淘汰率和返情率,而黃芪多糖粉的這一效果并不明顯。
【關(guān)鍵詞】：PRRS殘留毒 巨噬細(xì)胞 黃芪多糖粉 板藍(lán)根顆粒 熒光定量RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒研究進(jìn)展13-18
• 1.1 PRRSV流行病學(xué)概述13-14
• 1.2 PRRSV病原檢測方法14-18
• 2 黃芪多糖粉的研究進(jìn)展18-19
• 2.1 黃芪多糖粉的組成18
• 2.2 黃芪多糖粉的免疫功效18-19
• 3 板藍(lán)根顆粒的研究進(jìn)展19-22
• 3.1 板藍(lán)根顆粒的組成20
• 3.2 板藍(lán)根顆粒的免疫增強(qiáng)功效20
• 3.3 板藍(lán)根顆�？咕鬃饔�20
• 3.4 板藍(lán)根顆粒的抗病毒功效20-21
• 3.5 板藍(lán)根顆�？鼓[瘤作用21-22
• 第二章 黃芪多糖粉及板藍(lán)根顆粒調(diào)節(jié)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的研究22-28
• 1 材料與方法22-24
• 1.1 植物多糖22
• 1.2 主要試劑及配制22
• 1.3 動(dòng)物及分組處理22-23
• 1.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的測定23
• 1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析23-24
• 2 結(jié)果24-26
• 3 討論26-28
• 第三章 熒光定量RT-PCR檢測PRRSV核酸殘留毒方法建立28-43
• 1 主要試劑與儀器28-29
• 1.1 主要儀器28
• 1.2 主要試劑28-29
• 2 實(shí)驗(yàn)方法29-33
• 2.1 重組質(zhì)粒PMD-ORF_7的制備與鑒定29-32
• 2.2 熒光定量RT-PCR的條件優(yōu)化32-33
• 3 結(jié)果33-40
• 3.1 重組質(zhì)粒PMD-ORF7的鑒定與濃度測定33-34
• 3.2 熒光定量RT-PCR條件優(yōu)化34-35
• 3.3 ORF7-Power SYBR Green RT-PCR敏感性檢測結(jié)果35-36
• 3.4 ORF7-Power SYBR Green RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線生成36-38
• 3.5 ORF7-Power SYBR Green RT-PCR特異性檢測結(jié)果38-39
• 3.6 ORF7-Power SYBR Green RT-PCR重復(fù)性檢測結(jié)果39-40
• 4 討論40-43
• 第四章 板藍(lán)根顆粒及黃芪多糖粉降低豬血液中PRRSV核酸載量的研究43-57
• 1 材料43
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物43
• 1.2 試驗(yàn)藥物43
• 1.3 主要試劑及配置43
• 1.4 主要儀器設(shè)備43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 2.1 篩選帶毒豬43-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物投喂44-45
• 2.3 熒光定量PCR檢測血液病毒載量變化過程45
• 3 結(jié)果45-55
• 3.1 帶毒母豬篩選結(jié)果45-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)分組結(jié)果47-48
• 3.3 血液病毒核酸載量變化結(jié)果48-54
• 3.4 各組母豬發(fā)情率及淘汰率的比較54-55
• 4 討論55-57
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 致謝62-63
• 作者簡介及其攻讀碩士學(xué)位期間學(xué)術(shù)論文發(fā)表情況63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1113623