本文關(guān)鍵詞：IFN-γ誘導(dǎo)的犬免疫相關(guān)GTP酶在弓形蟲感染中的作用

  更多相關(guān)文章： 免疫相關(guān)GTP酶M 鳥苷酸結(jié)合蛋白 納蟲空泡 弓形蟲 CRISPR/Cas9

【摘要】：弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機(jī)會性致病原蟲,可引起弓形蟲病。全球約有三分之一的人感染有弓形蟲,我國感染率約為5%-10%。弓形蟲為躲避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷作用,會寄生在宿主免疫系統(tǒng)難以覆蓋的器官,例如通過血腦屏障入侵動物或人的大腦中引起神經(jīng)癥狀或者記憶衰退;越過血眼屏障引起視力障礙;也能通過血胎屏障導(dǎo)致人和動物的流產(chǎn)。目前尚無有效的疫苗預(yù)防該病,因此弓形蟲病嚴(yán)重威脅人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。弓形蟲在侵入宿主細(xì)胞形成不與宿主細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)相融合的納蟲空泡膜,其在保護(hù)弓形蟲體免受宿主細(xì)胞內(nèi)天然免疫系統(tǒng)的殺傷過程中起著非常重要的作用。另外,有研究表明病原體侵入宿主機(jī)體后會誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生包括促炎性細(xì)胞因子和干擾素在內(nèi)的大量天然免疫分子的表達(dá)。炎性細(xì)胞因子可增加血管通透性,提高吞噬細(xì)胞和免疫因子對弓形蟲的殺傷作用。在小鼠中,干擾素可通過作用于細(xì)胞表面受體誘導(dǎo)大量內(nèi)源性天然免疫蛋白的表達(dá),其中在抵御弓形蟲感染中發(fā)揮主力作用的是免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)和鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBPs),它們能夠在Irgms的“引導(dǎo)”下定位到納蟲空泡膜上,形成類似“攻膜復(fù)合體”的結(jié)構(gòu),使得弓形蟲納蟲空泡膜發(fā)生囊泡化,進(jìn)而被破壞,迫使其包裹的弓形蟲被釋放并為宿主細(xì)胞內(nèi)的天然分子所消滅和清除。本研究旨在探究犬中的IRGs是否在抵御弓形蟲感染中也發(fā)揮著重要的作用。首先,通過將IRGM4、IRGM5及IRGM6與GST標(biāo)簽蛋白融合進(jìn)行原核表達(dá),制備出重組蛋白,免疫小鼠分別制備出抗IRGM4、IRGM5以及IRGM6的特異性多克隆抗體以進(jìn)行IRGM4、IRGM5及IRGM6的內(nèi)源性表達(dá)的檢測。然后,設(shè)計出特異性針對IRGM4、IRGM5及IRGM6的正向和反向gRNA,將其與Cas9同時轉(zhuǎn)染MDCK中,建立以上三個基因缺失的細(xì)胞系,并應(yīng)用Western blot方法對基因缺失狀況進(jìn)行驗(yàn)證。最后,通過IRGM4ko、IRGM5ko、IRGM6ko和正常的MDCK細(xì)胞在IFNγ誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)條件下納蟲空泡內(nèi)弓形蟲生長情況的比較,統(tǒng)計分析犬的IRGMs在抵御弓形蟲生長中的作用。本研究表明犬的IRGM4、IRGM5及IRGM6均在抑制納蟲空泡內(nèi)弓形蟲的生長中具有重要的作用。在IFNγ未誘導(dǎo)的情況下,IRGM4、IRGM5及IRGM6三個基因缺失的細(xì)胞系與正常MDCK細(xì)胞中弓形蟲的生長并不存在明顯差異。因此,單個IRGM4和IRGM5存在的條件下并未使MDCK細(xì)胞具有抵御弓形蟲感染的作用,可能的原因是IRGs家族以復(fù)合體的形式抵御弓形蟲的感染。
【關(guān)鍵詞】：免疫相關(guān)GTP酶M 鳥苷酸結(jié)合蛋白 納蟲空泡 弓形蟲 CRISPR/Cas9
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.292
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-14
• 第一章 引言14-19
• 1.1 干擾素誘導(dǎo)GTP酶家族基因的表達(dá)14-15
• 1.2 IRGs的結(jié)構(gòu)與分布15-16
• 1.3 IRGs靶向于病原囊泡16-17
• 1.4 IRGs與病原囊泡的相互作用17
• 1.5 本研究的主要內(nèi)容17-19
• 第二章 IRGM4、IRGM5和IRGM6抗體的制備19-25
• 2.1 材料與方法19-21
• 2.1.1 主要試劑和細(xì)胞系19
• 2.1.2 MDCK細(xì)胞的體外培養(yǎng)19
• 2.1.3 IRGM4、IRGM5和IRGM6原核表達(dá)引物的設(shè)計19-20
• 2.1.4 顆粒性抗原的制備20
• 2.1.5 可溶性融合抗原的制備20-21
• 2.1.6 抗IRGMs抗體的制備21
• 2.1.7 內(nèi)源性IRGMs的表達(dá)的檢測21
• 2.2 結(jié)果21-23
• 2.2.1 IRGM4、IRGM5以及IRGM6序列分析21
• 2.2.2 GST與IRGM4、IRGM5和IRGM6融合表蛋白的制備21-22
• 2.2.3 內(nèi)源性IRGM4、IRGM5和IRGM6表達(dá)的檢測22-23
• 2.3 討論23-25
• 第三章 IRGM4、IRGM5和IRGM6基因敲除細(xì)胞系的建立25-33
• 3.1 材料與方法25-28
• 3.1.1 主要試劑25
• 3.1.2 gRNA的選擇25-26
• 3.1.3 sgRNA的構(gòu)建26-27
• 3.1.4 MDCK細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與敲除27
• 3.1.5 IRGM6基因缺失細(xì)胞系的建立27-28
• 3.1.6 IRGM4和IRGM5的基因敲除細(xì)胞系的的建立28
• 3.1.7 基因缺失細(xì)胞系的鑒定28
• 3.2 結(jié)果28-31
• 3.2.1 IRGM4、IRGM5以及IRGM6的基因編輯28-30
• 3.2.2 IRGM4、IRGM5以及IRGM6基因缺失的western blot鑒定30-31
• 3.3 討論31-33
• 第四章 IRGMS在抗弓形蟲中的作用33-42
• 4.1 材料與方法34
• 4.1.1 主要材料、弓形蟲株和細(xì)胞系34
• 4.1.2 弓形蟲感染和納蟲空泡內(nèi)弓形蟲數(shù)比較的試驗(yàn)方法34
• 4.1.3 弓形蟲的體外培養(yǎng)34
• 4.2 結(jié)果34-40
• 4.2.1 IFNγ誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞對弓形蟲生長的作用35-36
• 4.2.2 在未經(jīng)IFNγ誘導(dǎo)的條件下IRGMs基因缺失細(xì)胞系對弓形蟲生長的作用36-38
• 4.2.3 在經(jīng)IFNγ誘導(dǎo)的條件下IRGMs基因缺失細(xì)胞系對弓形蟲生長的作用38-40
• 4.3 討論40-42
• 第五章 結(jié)論42-44
• 5.1 全文總結(jié)42
• 5.2 研究展望42-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 作者簡歷50

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