發(fā)布時間：2017-10-28 13:33

  本文關(guān)鍵詞：廣西BTV感染及傳播媒介調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究

  更多相關(guān)文章： 藍(lán)舌病毒 中和試驗 病原分離 病毒鑒定 動物攻毒試驗

【摘要】：藍(lán)舌病(bluetongue, BT)是由藍(lán)舌病毒(bluetongue virus, BTV)引起的出血性疾病,目前已報道27個血清型。BT廣泛分布于溫帶、亞熱帶及熱帶地區(qū),通過嗜血媒介昆蟲吮吸帶毒血液后叮咬易感動物傳播,反芻動物均能感染,羊、牛為本病主要易感動物。利用本實驗室采集2009-2015年廣西13市6683份牛羊血清,在檢測出2032份BTV抗體陽性血清樣品中,以C-ELISA方法篩選出500份強(qiáng)陽性血清,與OIE公布的BTV 1-24型標(biāo)準(zhǔn)毒株分別進(jìn)行微量血清中和試驗,發(fā)現(xiàn)廣西畜群中存在BTV-1、2、3、4、5、8、9、11、15、16、17、18、19、20、22、23及24等17個血清型。其中,BTV-5、8、11、13、17、18、19、20、22為國內(nèi)首次報道。統(tǒng)計分析表明,BTV-1、2和4為廣西流行的優(yōu)勢血清型。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),廣西畜群存在BTV不同血清型的混合感染。本研究在南寧市隆安縣、玉林市興業(yè)縣、北海市合浦縣設(shè)立三處監(jiān)控點(diǎn)并對監(jiān)控點(diǎn)采集的傳播媒介樣品進(jìn)行鑒定。共鑒定出7個庫蠓品種,除已報道過的尖喙庫蠓、肩宏庫蠓、荒川庫蠓、異域庫蠓,還新發(fā)現(xiàn)了淡角庫蠓、光胸庫蠓和無害庫蠓。其中尖喙庫蠓、荒川庫蠓、異域庫蠓為已知的BTV傳播媒介。對監(jiān)控點(diǎn)采集的2015年10-11月份哨兵動物的100份肝素鈉抗凝血進(jìn)行病毒分離,以雞胚接種(E)、 BHK 21細(xì)胞傳代(B)、C6/36細(xì)胞傳代(A)三種途徑共分離得到23株病毒。通過AC-ELISA及qPCR方法鑒定,其中18株為BTV。通過微量病毒中和試驗及病毒型特異性基因VP2擴(kuò)增確定分離毒株的血清型。目前已確定5株病毒分屬3個血清型,除一株為羊源BTV-16外,其余4株為牛源毒株,包括BTV-1、BTV-21各一株,BTV-16二株。對上述毒株的VP2、VP7和NS3/NS3A三個基因節(jié)段進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)廣西分離株的上述基因大部分屬于BTV東方亞群,與日本、印度株同源性高。但來自羊源BTV-16的VP7節(jié)段卻屬于西方亞群,提示,該毒株的基因組可能發(fā)生分子重配,該片段或許來自外來毒株。選取牛源BTV-16型毒株人工感染牛與豬,對其致病性進(jìn)行初步研究。攻毒8天后,實驗牛僅觀察到鼻黏膜充血,剖檢僅見咽喉黏膜充血,睪丸有出血點(diǎn)等輕微病變,未觀察到舌發(fā)紺,口腔潰瘍,肺充血、水腫等BT典型癥狀; qPCR檢測顯示,外周血液中的病毒含量最高,其次是肺臟和脾臟,病毒的體內(nèi)分布與早前報道一致。而在40天的試驗周期內(nèi),試驗豬各組織器官中均未檢出BTV核酸,表明分離毒株在豬體內(nèi)不增殖。
【關(guān)鍵詞】：藍(lán)舌病毒 中和試驗 病原分離 病毒鑒定 動物攻毒試驗
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 常用縮寫詞9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-24
• 1.1 BTV及其與機(jī)體相互作用14-18
• 1.1.1 BTV的病原學(xué)14-17
• 1.1.2 BTV與機(jī)體的相互作用17-18
• 1.2 BTV的流行態(tài)勢18-19
• 1.2.1 BT的世界性分布18-19
• 1.2.2 BTV媒介的分布研究19
• 1.2.3 BT在中國的流行19
• 1.3 BT的診斷與防控19-23
• 1.3.1 BT的診斷19-21
• 1.3.2 BT防控21-23
• 1.4 研究目的23-24
• 第二章 廣西地區(qū)BTV感染及傳播媒介調(diào)查24-47
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 反芻動物血清樣品來源24
• 2.1.2 廣西蟲媒病監(jiān)控點(diǎn)建立及媒介昆蟲樣品的采集24-25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 主要儀器25-26
• 2.2 方法26-31
• 2.2.1 技術(shù)路線26
• 2.2.2 廣西BTV血清型調(diào)查26-28
• 2.2.2.1 C-ELISA方法篩選BTV陽性血清26-27
• 2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)毒株的準(zhǔn)備27-28
• 2.2.2.3 微量細(xì)胞中和試驗檢28
• 2.2.3 媒介昆蟲調(diào)查28-31
• 2.2.3.1 監(jiān)控點(diǎn)庫蠓形態(tài)學(xué)鑒定29-30
• 2.2.3.2 庫蠓線粒體基因的擴(kuò)增30-31
• 2.2.3.3 監(jiān)控點(diǎn)庫蠓種類分析與統(tǒng)計31
• 2.3 結(jié)果31-45
• 2.3.1 BTV血清學(xué)調(diào)查結(jié)果31-38
• 2.3.1.1 廣西BTV陽性血清篩查結(jié)果31-33
• 2.3.1.2 廣西BTV的血清型的檢測結(jié)果33-36
• 2.3.1.3 BTV血清型氣候因素及分布地域差異分析36-38
• 2.3.4 媒介昆蟲調(diào)查結(jié)果38-45
• 2.3.4.1 庫蠓翅膀形態(tài)學(xué)觀察38-43
• 2.3.4.2 庫蠓線粒體基因的序列比對43-44
• 2.3.4.3 監(jiān)控點(diǎn)庫蠓種類分析44-45
• 2.4 討論45-47
• 第三章 病毒分離與鑒定47-87
• 3.1 材料47-48
• 3.1.1 血液樣本47
• 3.1.2 媒介昆蟲樣本47
• 3.1.3 實驗材料47-48
• 3.1.4 實驗儀器48
• 3.2 方法48-60
• 3.2.1 技術(shù)路線48
• 3.2.2 病毒分離48-50
• 3.2.2.1 媒介昆蟲(庫蠓、伊蚊)攜帶病毒的細(xì)胞接種分離48
• 3.2.2.2 哨兵動物血液中病毒的細(xì)胞接種分離培養(yǎng)48-50
• 3.2.2.2.1 細(xì)胞接種分離病毒48-49
• 3.2.2.2.2 雞胚-細(xì)胞接種分離法49-50
• 3.2.3 分離病毒的鑒定50-52
• 3.2.3.1 分離病毒AC-ELISA鑒定50
• 3.2.3.2 分離病毒的Real-Time PCR鑒定50-52
• 3.2.4 分離毒株TCID_(50)的測定52-53
• 3.2.5 分離病毒血清型鑒定53-56
• 3.2.5.1 病毒中和試驗確定分離毒株血清型53
• 3.2.5.2 擴(kuò)增BTV-VP2確定分離毒株血清型53-56
• 3.2.6 分離BTV的VP7與NS3/3A基因序列的擴(kuò)增56-58
• 3.2.7 dsRNA病毒檢測58-60
• 3.2.7.1 總RNA提取58-59
• 3.2.7.2 dsRNA的純化59
• 3.2.7.3 dsRNA電泳59
• 3.2.7.4 八種蟲媒病毒鑒定59-60
• 3.2.8 病毒序列分析60
• 3.3 結(jié)果60-85
• 3.3.1 媒介昆蟲攜帶病毒的細(xì)胞接種分離60-62
• 3.3.2 監(jiān)控點(diǎn)哨兵動物病毒的分離62-67
• 3.3.2.1 哨兵動物血液病毒細(xì)胞途徑分離結(jié)果62-65
• 3.3.2.2 哨兵動物血液病毒雞胚-細(xì)胞途徑分離結(jié)果65-67
• 3.3.3 分離病毒的鑒定結(jié)果67-68
• 3.3.3.1 AC-ELISA鑒定結(jié)果67
• 3.3.3.2 Real-Time PCR鑒定結(jié)果67-68
• 3.3.4 分離病毒的TCID_(50)測定68-69
• 3.3.5 分離病毒的血清型鑒定結(jié)果69-71
• 3.3.5.1 分離毒株的病毒中和試驗結(jié)果69
• 3.3.5.2 BTV的VP2基因擴(kuò)增結(jié)果69-71
• 3.3.6 dsRNA病毒的電泳鑒定結(jié)果71-72
• 3.3.7 分離BTV的VP7、NS3/NS3A擴(kuò)增結(jié)果72-73
• 3.3.7.1 BTV的VP7基因擴(kuò)增結(jié)果72-73
• 3.3.7.2 BTV的NS3/NS3A基因擴(kuò)增結(jié)果73
• 3.3.8 分離BTV的VP2、VP7、NS3/NS3A序列分析73-85
• 3.3.8.1 BTV的VP2序列分析73-79
• 3.3.8.2 BTV的VP7序列分析79-80
• 3.3.8.3 BTV的NS3/NS3A序列分析80-85
• 3.4 討論85-87
• 第四章 動物攻毒實驗87-95
• 4.1 材料87
• 4.1.1 實驗動物87
• 4.1.2 實驗材料87
• 4.1.3 實驗儀器87
• 4.2 方法87-89
• 4.2.1 技術(shù)路線87
• 4.2.2 分離毒株(牛血毒)回歸實驗87-88
• 4.2.3 攻毒牛臨床癥狀及病理剖解變化觀察88
• 4.2.4 攻毒牛組織臟器中BTV增殖情況的測定88
• 4.2.5 攻毒牛血清抗體水平及毒血癥的檢測情況88
• 4.2.6 雞胚致死實驗88
• 4.2.7 BTV感染豬的實驗88-89
• 4.3 結(jié)果89-93
• 4.3.1 血毒回歸Real-Time PCR檢測血液中病毒核酸含量89-90
• 4.3.2 攻毒牛血清抗體水平及毒血癥變化情況90
• 4.3.3 攻毒牛外周血及各組織臟器BTV核酸含量的測定90-91
• 4.3.4 測血毒毒價91
• 4.3.5 雞胚致死實驗91-92
• 4.3.6 豬感染實驗92-93
• 4.4 討論93-95
• 第五章 全文總結(jié)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-109
• 附錄1109-110
• 附錄2110-129
• 致謝129-130
• 在讀期間發(fā)表論文情況130

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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本文編號：1108486