發(fā)布時間：2017-10-27 22:20

  本文關鍵詞：上海地區(qū)PCV2分子流行病學及PCV2感染豬肺泡巨噬細胞的磷酸化蛋白組學研究

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus diseases,PCVD)的主要病原,嚴重危害豬群健康的全球性重要的傳染病。近年來,國內外有關PCV2感染報道日益增多,引起人們廣泛的關注。為了了解上海地區(qū)PCV2流行狀況,我們對PCV2開展了流行病學調查,并對PCV2進行了遺傳變異分析。我國大多數(shù)地區(qū)豬群中PCV2的感染十分普遍,PCV2可能是一種豬場常在病原體,其中PCV2與其他病原體共感染現(xiàn)象非常嚴重。本實驗借助蛋白質組學和磷酸化修飾手段先從體外實驗分析PCV2感染豬肺泡巨噬細胞系(porcine alveolar macrophage,PAM)后細胞因子表達和蛋白質組學變化,探討PCV2感染誘導炎癥反應的機理,具體研究內容如下:1.PCV2分子流行病學調查2014年到2015年初期間,從上海浦東、閔行、嘉定、奉賢的所有規(guī)�；i場中的疑似PCVD患病豬群和正常豬群中采集組織樣品,采用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法,分別檢測PCV1、PCV2。結果表明,PCV2感染陽性率為64.20%,從陽性病料中測序鑒定到10條PCV2序列,對其ORF2基因進行測序及分子遺傳演化分析。結果發(fā)現(xiàn),上海地區(qū)發(fā)病豬群中PCV2d為優(yōu)勢流行基因型,在同一豬場中同時存在PCV2d、PCV2b及PCV2e。表明PCV2不同基因型毒株在豬體內存在序列漂移現(xiàn)象。PCV2的ORF2同源性分析表明,本研究中的10株PCV2毒株之間同源性為90.3%~99%;10株PCV2毒株與國內毒株間同源性高達90.3%~99.3%,與國外毒株間同源性為90.0%~99.7%。表明國內、外PCV2毒株序列沒有明顯的地域差異。2.PCV2感染豬肺泡巨噬細胞的磷酸化蛋白質組學研究本文分別利用實時熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和間接免疫熒光技術(indirect immunoinfluscent assay,IFA)檢測各個時間點PCV2的病毒滴度和不同細胞因子(IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β)的mRNA表達水平,以此為依據(jù),確定PCV2感染豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)的早期和晚期時間點,分別是24 h和60 h。利用同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantificationI,iTRAQ)定量組學的方法分別在PCV2感染后的24 h和60 h時研究磷酸化蛋白質的變化。本次研究中,我們鑒定了925獨特的磷酸化蛋白,24 h和60 h鑒定到692個和691個磷酸化蛋白,這些磷酸化蛋白的變化為探究PCV2免疫抑制和致病機制提供了大量信息。分析磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)PCV2在感染宿主細胞時,抑制細胞凋亡,促進自噬,可能是由于Hippo和Notch信號通路以及磷酸肌醇信號的激活,導致部分蛋白質激酶發(fā)生變化。互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)這些PCV2誘導而產(chǎn)生變化的磷酸化蛋白涉及到的生物過程包括細胞裝配和組成、信號轉導、蛋白合成、核酸代謝、新陳代謝、細胞活動等。這些信號通路和功能網(wǎng)絡分析有助于我們進一步理解PCV2的致病機理,本研究為PCV2感染引起的免疫抑制和致病機制提供了基礎數(shù)據(jù)。
【關鍵詞】：PCV2 豬肺泡巨噬細胞 磷酸化蛋白質組 遺傳變異
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-15
• 第一章 文獻綜述15-22
• 1.1 豬圓環(huán)病毒2型的發(fā)現(xiàn)及其流行病學發(fā)展15-16
• 1.1.1 PCV2的發(fā)現(xiàn)15
• 1.1.2 PCV2的流行與分布15
• 1.1.3 PCV2基因型分類和變化15-16
• 1.2 PCV2引起的相關疾病16-19
• 1.2.1 PMWS16
• 1.2.2 PRDC16-17
• 1.2.3 PDNS17
• 1.2.4 母豬繁殖障礙17
• 1.2.5 CT17-18
• 1.2.6 PNP18
• 1.2.7 與豬其他病原體并發(fā)感染18-19
• 1.3 PCV2致病機理19-20
• 1.3.1 PCV2免疫抑制機理19
• 1.3.2 PCV2感染與凋亡19-20
• 1.4 磷酸化蛋白質組學在病毒感染中的應用20-22
• 1.4.1 蛋白質磷酸化修飾簡介20
• 1.4.2 病毒感染與磷酸化作用研究進展20-22
• 第二章 上海地區(qū)PCV2分子流行病學調查22-36
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 試劑22
• 2.1.2 病料22-23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 病料的處理23
• 2.2.2 提取病料組織中病毒的DNA/RNA23
• 2.2.3 病料中PCV1和PCV2檢測23-24
• 2.2.4 PCV2-ORF2基因擴增24-25
• 2.2.5 PCV2-ORF2 PCR產(chǎn)物的回收純化25
• 2.2.6 回收PCR產(chǎn)物連接PMD18-T載體25
• 2.2.7 制備感受態(tài)細胞25-26
• 2.2.8 連接產(chǎn)物的轉化感受態(tài)細胞26
• 2.2.9 質粒小量的制備26-27
• 2.2.10 質粒PCR電泳鑒定27
• 2.2.11 序列測定與遺傳變異分析27
• 2.3 結果27-34
• 2.3.1 病料中PCV1和PCV2基因擴增結果27-28
• 2.3.2 PCV2-ORF2基因擴增結果28-29
• 2.3.3 PCV2-ORF2-pMD-18T重組質粒的PCR鑒定29
• 2.3.4 PCV2-ORF2測序結果29-30
• 2.3.5 PCV2-ORF2核苷酸序列遺傳進化分析30-33
• 2.3.6 PCV2-ORF2編碼的氨基酸序列分析33-34
• 2.3.7 PCV2-ORF2核苷酸與氨基酸序列同源性分析34
• 2.4 討論34-36
• 第三章 PCV2感染豬肺泡巨噬細胞磷酸化蛋白質組學研究36-53
• 3.1 材料36
• 3.1.1 毒株、質粒和細胞36
• 3.1.2 主要試劑36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 磷酸化蛋白質組學分析時間點的確定37-38
• 3.2.1.1 病毒接種37
• 3.2.1.2 間接免疫熒光法(IFA)檢測PCV237
• 3.2.1.3 SYBR Green實時RT-PCR法檢測細胞因子mRNA的變化37-38
• 3.2.4 細胞樣品制備38
• 3.2.5 蛋白提取和酶解38-39
• 3.2.6 肽段標記和磷酸化肽段富集39
• 3.2.7 LC?MS/MS分析39
• 3.2.8 數(shù)據(jù)分析39
• 3.2.9 生物信息學分析39-40
• 3.3 結果40-51
• 3.3.1 PCV2檢測時間點的確定40-41
• 3.3.1.1 IFA檢測PCV2在PAM細胞系上的增殖40
• 3.3.1.2 SYBR Green實時RT-PCR法檢測細胞因子IL-6、IL-8、IL-1β、IL-10的變化40-41
• 3.3.2 利用ITRAQ LC?MS/MS對PCV2感染的PAM細胞進行磷酸化蛋白質組學的定量分析41-42
• 3.3.3 亞細胞定位和功能注釋分析42-45
• 3.3.4 磷酸化蛋白參與信號通路分析45-47
• 3.3.5 磷酸化蛋白間相互分析47-51
• 3.4 討論51-53
• 第四章 全文結論53-54
• 參考文獻54-60
• 附錄 160-62
• 附錄 262-74
• 致謝74-75
• 作者簡歷75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王海燕;劉文博;高崧;劉秀梵;;載體表達的siRNA分子對豬圓環(huán)病毒2型復制的抑制作用[J];微生物學報;2008年11期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李文潔;我國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）分子流行病學調查[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2009年

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本文編號：1105456