本文關鍵詞：重組hIFITM3腺病毒的構建及抗流感病毒作用研究

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【摘要】：近年發(fā)現(xiàn)的一類宿主限制因子,干擾素誘導跨膜蛋白(IFITMs)。該類因子可抑制包膜和無包膜病毒的增殖,并且在多種細胞中有一定的組成型表達,其中經研究證實IFITM3可以抵抗多種病毒的感染,其中包括西尼羅河病毒,流感病毒,登革熱等。FITM3可通過多種途徑來發(fā)揮抗病毒感染作用。據(jù)報道,IFITM3對以H1N1、H5N1、H7N9及H3N2、為外膜的假型病毒的進入具有抑制作用。其能夠有效作用于宿主細胞表面受體與流感病毒表面糖蛋白血凝素結合之后,包膜與內吞形成的胞內體膜融合之前的感染胞內體過程。為深入研究IFITM3的抗病毒作用,本研究首先利用腺病毒pacAd載體構建了含有人干擾素誘導跨膜蛋白IFITM3目的基因的穿梭質粒,再與骨架質粒pAd5共轉染HEK-293細胞,包裝出含IFITM3基因的重組腺病毒,隨后用PCR及Western blot檢測該重組野生型腺病毒、腺病毒與正常細胞中IFITM3蛋白表達量的差異。本研究同時用Western blot方法檢測同源細胞A549和異源細胞MDCK中IFITM3蛋白的表達,以選擇合適的細胞模型。用MTS方法分別檢測重組腺病毒對MDCK和A549細胞活性的影響。流感病毒感染細胞,用MTS方法,選擇病毒滴度為100 MOI、感染時間為24h進行實驗,檢測細胞活性變化。MDCK口A549細胞接種重組腺病毒以及流感病毒后12h、24h、36h和48h分別收取RNA和細胞蛋白,用實時熒光定量PCR方法檢測流感病毒M2基因表達量,用Western blot方法檢測流感病毒HA蛋白表達量。PCR及Western blot檢測顯示本研究新構建的重組腺病毒IFITM3蛋白表達量顯著高于野生型腺病毒和正常細胞,表明成功構建含有IFITM3的重組腺病毒。MTS實驗發(fā)現(xiàn)腺病毒對細胞活性有一定抑制作用且具有時間和劑量依賴性,但rAd-IFITM3與wtAd5組之間無顯著性差異,而流感病毒在感染細胞24h后,對細胞產生明顯的抑制作用,且呈明顯的時間與劑量依賴效應。Western blot結果顯示,在接種流感病毒后12h時,HA蛋白的表達量最低且顯著低于其他時間點。熒光定量PCR結果表明,過表達ITIFM3的A549細胞在不同時間點均對流感病毒轉錄水平有明顯的抑制作用；對于MDCK細胞,6h、12h具有明顯抑制作用。綜上所述,本實驗成功構建了含有IFITM3基因的重組腺病毒rAd-IFITM3,該重組腺病毒rAd-IFITM3在接種MDCK和A549細胞后,可在蛋白表達水平和基因轉錄水平上對流感病毒起到抑制的作用。本研究為深入探討IFITM3限制病毒感染的作用機制提供了基礎。
【關鍵詞】：干擾素誘導跨膜蛋白3 禽流感病毒 腺病毒 抑制作用
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 前言12-26
• 1 抗流感病毒主要宿主限制因子研究進展12-20
• 1.1 流感病毒概述12
• 1.2 宿主限制因子抗流感病毒作用12-20
• 2 IFITMs研究進展20-24
• 2.1 IFITMs家族20-21
• 2.2 IFITMs廣譜抗病毒作用21-22
• 2.3 IFITMs蛋白結構和細胞分布22-23
• 2.4 IFITM3抗病毒作用機制23-24
• 3 本研究的目的與意義24-26
• 材料和方法26-45
• 1 材料26-29
• 1.1 細胞、質粒、酶26
• 1.2 主要試劑26-27
• 1.3 主要儀器27-28
• 1.4 主要溶液及培養(yǎng)基28-29
• 2 方法29-45
• 2.1 含hIFITM3基因的重組腺病毒穿梭質粒的構建與鑒定29-31
• 2.2 攜帶hIFITM3基因的重組腺病毒的包裝31-35
• 2.3 重組腺病毒的鑒定35-40
• 2.4 重組腺病毒擴增及滴度測定40-41
• 2.5 重組腺病毒表達IFITM3蛋白體外抗流感作用分析41-45
• 結果45-59
• 1 含hIFITM3基因的重組腺病毒穿梭質粒的鑒定45-46
• 1.1 目的基因的獲取45
• 1.2 含IFITM3基因重組腺病毒穿梭質粒的鑒定45-46
• 2 攜帶IFITM3基因的重組腺病毒包裝46-48
• 2.1 質粒大提與濃度鑒定46
• 2.2 質粒線性化46-47
• 2.3 質粒抽提純化47
• 2.4 重組腺病毒轉染(包裝)47-48
• 3 重組腺病毒的鑒定48-50
• 3.1 細胞基因組提取及PCR鑒定48-49
• 3.2 重組腺病毒PCR鑒定49
• 3.3 Western blot分析靶蛋白表達49-50
• 3.4 Western blot分析IFITM3在細胞中的定位50
• 4 重組腺病毒擴增及滴度測定50-53
• 4.1 重組腺病毒擴增50-51
• 4.2 重組腺病毒滴度測定51-52
• 4.3 重組腺病毒電鏡觀察52-53
• 5 重組腺病毒表達IFITM3蛋白體外抗流感作用分析53-59
• 5.1 MTS分析腺病毒對細胞活性或增值的影響53-54
• 5.2 重組腺病毒在細胞中過表達外源基因研究54-56
• 5.3 重組腺病毒體外抗流感作用研究56-59
• 討論59-61
• 結論61-62
• 參考文獻62-68
• 致謝68-70
• 作者簡介70

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