發(fā)布時(shí)間：2017-10-24 02:34

  本文關(guān)鍵詞：黃連與環(huán)丙沙星聯(lián)用對(duì)雞源性沙門菌生物被膜的影響

  更多相關(guān)文章： 黃連 環(huán)丙沙星 沙門菌 生物被膜 聯(lián)合用藥

【摘要】：沙門菌病(salmonellosis)是指各類沙門菌所導(dǎo)致的不同臨床表現(xiàn)的疾病總稱,人畜感染后常表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、局部化膿感染等癥狀,給畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生均帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。近年來,由于抗菌藥物的濫用,使得沙門菌耐藥性問題日益嚴(yán)重,甚至形成細(xì)菌生物被膜。細(xì)菌生物被膜(Bacterial biofilm,BF)是黏附于載體表面,分泌胞外大分子物質(zhì)并將其自身包繞其中而形成的細(xì)菌聚集膜樣物。研究顯示,生物被膜形成可引起沙門菌耐藥性的產(chǎn)生,臨床上80%的感染都和生物被膜相關(guān),這就迫切需要開發(fā)新型抗菌藥。由于中草藥在抑制細(xì)菌生物被膜時(shí)具有不易產(chǎn)生耐藥性和毒副作用等優(yōu)勢(shì),且與抗菌藥物聯(lián)用能發(fā)揮抗菌增效協(xié)同的作用,而越來越受到青睞。因此,本課題篩選出對(duì)耐藥沙門菌有較好抑菌效果的中藥,研究其與環(huán)丙沙星(ciprofloxacin,CIP)體外聯(lián)用對(duì)生物被膜的影響,以及對(duì)生物被膜形成相關(guān)基因lux S、rpo E和omp R表達(dá)的調(diào)控作用。利用Kirby-Bauer法檢測(cè)12株沙門菌分離株對(duì)10種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示,分離株對(duì)氨芐西林的耐藥率最高,為58.3%;對(duì)諾氟沙星的耐藥率達(dá)到50%;對(duì)卡那霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、四環(huán)素的耐藥率也較高,分別為41.7%、41.7%、33.3%、25%。多重耐藥率為41.7%(5/12),耐藥譜以AMP-GEN-CFZ-KAN為主,其中8號(hào)分離株可耐9種抗菌藥物,耐藥表型最為復(fù)雜,選作實(shí)驗(yàn)菌株。以75%乙醇為溶劑,采用超聲波法分別提取黃連、黃芩、五倍子、丁香葉,得到4味中藥醇提物;采用96孔板微量稀釋法測(cè)定中藥醇提物和環(huán)丙沙星對(duì)沙門菌最低抑菌濃度(minimal inhibition concentration,MIC)值。結(jié)果顯示,黃連較其他味3中藥表現(xiàn)出較好的抑菌效果(MIC=6250μg·mL-1)。將黃連醇提物進(jìn)一步精提后,得到粗品5.31 g,提取率為8.17%,MIC值為3125μg·mL-1。利用微量棋盤法測(cè)定黃連提取物與環(huán)丙沙星體外聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,兩藥聯(lián)用FIC指數(shù)為0.75,說明兩藥聯(lián)用為相加作用。在96微孔板中采用結(jié)晶染色法分別測(cè)定兩藥單用以及兩藥聯(lián)用對(duì)生物被膜黏附率(B)值的影響;利用XTT試劑,繪制生物被膜生長(zhǎng)曲線;在24孔板中制備生物被膜,利用掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)觀察沙門菌生物被膜結(jié)構(gòu),以及不同濃度藥物對(duì)其的影響;采用RT-PCR法,檢測(cè)不同藥物對(duì)lux S、rpoE、omp R基因表達(dá)量的影響。生物被膜黏附率、生長(zhǎng)曲線以及掃描電鏡結(jié)果均表明,陽(yáng)性對(duì)照CVCC528菌株生物被膜形成能力極弱,8號(hào)分離株形成了典型而完整的生物被膜,且生長(zhǎng)速率隨著時(shí)間不斷變化,在18-30 h期間,細(xì)菌活力提高較快,在72 h達(dá)到最高。兩藥聯(lián)用表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制生物被膜黏附率、降低生長(zhǎng)速率,并嚴(yán)重破壞生物被膜的微觀結(jié)構(gòu),抑制lux S,rpo E和omp R基因mRNA表達(dá)的作用,其抑制效果與藥物濃度呈正相關(guān),在1/2MIC濃度時(shí)效果最好(p0.01),說明兩藥聯(lián)用對(duì)耐藥沙門菌產(chǎn)生增效協(xié)同作用,可相對(duì)減少環(huán)丙沙星的用藥劑量。綜上所述,黃連對(duì)沙門菌的抑制作用優(yōu)于黃芩,五倍子、丁香葉;黃連提取物與環(huán)丙沙星體外聯(lián)用提高了環(huán)丙沙星的抗菌效果;黃連、環(huán)丙沙星及兩藥聯(lián)用均能抑制耐藥沙門菌生物被膜的黏附率、生長(zhǎng)速率,并顯著破壞生物被膜的微觀結(jié)構(gòu),其在分子水平的作用機(jī)理與下調(diào)lux S,rpo E和omp R基因表達(dá)有關(guān),且聯(lián)合用藥在一定程度上表現(xiàn)出優(yōu)于單一用藥的作用。因此,黃連提取物與環(huán)丙沙星聯(lián)用在抑制細(xì)菌生物被膜方面有較大的應(yīng)用前景。本研究就目前中西醫(yī)結(jié)合來防治沙門菌臨床感染提供新的理論依據(jù),并為沙門菌生物被膜分子水平的相關(guān)耐藥機(jī)制的研究提供了新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：黃連 環(huán)丙沙星 沙門菌 生物被膜 聯(lián)合用藥
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-23
• 1.1 沙門菌概述12
• 1.1.1 沙門菌流行性12
• 1.1.2 沙門菌的耐藥現(xiàn)狀12
• 1.2 沙門菌的耐藥機(jī)制12-14
• 1.2.1 耐藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制12-13
• 1.2.2 沙門菌產(chǎn)生耐藥性的生化機(jī)制13-14
• 1.3 細(xì)菌生物被膜概述14-20
• 1.3.1 生物被膜的形成機(jī)制15
• 1.3.2 生物被膜形成的影響因素15-18
• 1.3.3 生物被膜的檢測(cè)方法18
• 1.3.4 細(xì)菌生物被膜的控制策略18-20
• 1.4 相關(guān)中藥研究進(jìn)展20-21
• 1.4.1 黃連20-21
• 1.4.2 黃芩21
• 1.4.3 五倍子21
• 1.4.4 丁香葉21
• 1.5 體外中西藥聯(lián)合用藥21-22
• 1.6 本研究目的與意義22-23
• 2 材料與方法23-34
• 2.1 試驗(yàn)材料23-25
• 2.1.1 菌株23
• 2.1.2 藥物23
• 2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.1.4 主要試劑24
• 2.1.5 藥敏紙片24
• 2.1.6 試劑盒24
• 2.1.7 主要試劑配制24-25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法25-34
• 2.2.1 細(xì)菌復(fù)蘇與凍存25
• 2.2.2 沙門菌分離株藥物敏感性試驗(yàn)25-26
• 2.2.3 藥物的最低抑菌濃度的測(cè)定26-27
• 2.2.4 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)27-28
• 2.2.5 生物被膜黏附率測(cè)定28-29
• 2.2.6 繪制生物被膜的生長(zhǎng)曲線29
• 2.2.7 生物被膜微觀結(jié)構(gòu)29-30
• 2.2.8 藥物對(duì)生物被膜相關(guān)基因的調(diào)控30-34
• 3 結(jié)果與分析34-46
• 3.1 沙門菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果34-35
• 3.2 沙門菌最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果35
• 3.2.1 中藥提取35
• 3.2.2 沙門菌最低抑菌濃度的測(cè)定35
• 3.3 黃連與環(huán)丙沙星體外聯(lián)用35-36
• 3.4 生物被膜黏附率測(cè)定結(jié)果36-38
• 3.5 生物被膜的生長(zhǎng)曲線38-39
• 3.6 生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)39-41
• 3.7 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果41-46
• 3.7.1 總RNA和引物電泳檢測(cè)結(jié)果41-42
• 3.7.2 qRT-PCR的溶解曲線42-43
• 3.7.3 qRT-PCR的擴(kuò)增曲線43
• 3.7.4 qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果43-46
• 4 討論46-51
• 4.1 沙門菌耐藥性分析46
• 4.2 中藥對(duì)沙門菌的抑菌作用46-47
• 4.3 中西藥聯(lián)用對(duì)沙門菌的抑制作用47-48
• 4.4 藥物對(duì)沙門菌生物被膜的影響48-49
• 4.5 藥物對(duì)生物被膜相關(guān)基因的調(diào)控49-51
• 5 結(jié)論51-52
• 致謝52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文59

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