本文關(guān)鍵詞：抗犬瘟熱病毒單域抗體庫的構(gòu)建與犬瘟熱基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

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【摘要】：犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起的一種高度接觸性的急性病毒病。臨床上以雙相熱,紅疹,結(jié)膜炎,白細胞減少及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主要特征。近年來,犬瘟熱疫苗的防治效果逐漸下降,而單克隆抗體以其較高的特異性被廣泛應(yīng)用于診斷和治療方面,因此犬瘟熱診斷治療制劑的研究開發(fā)對犬瘟熱的防治具有重要意義。駱駝體內(nèi)存在天然缺少輕鏈的重鏈抗體,重鏈抗體的優(yōu)點使其具有廣泛的抗原結(jié)合能力。噬菌體展示技術(shù)主要將抗體分子展示于噬菌體表面后利用抗原篩選,再進行表達和功能鑒定,使基因工程抗體制備方法更方便快捷。本研究旨在制備犬瘟熱病毒特異性單域抗體,同時選擇具有中和活性的單域抗體制備犬瘟熱單域抗體被動免疫制劑。通過犬瘟熱病毒免疫雙峰駝,分離外周血淋巴細胞后提取總RNA,再進行VHH基因的擴增。將VHH基因片段與pCANTAB5E載體連接,再將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化E.coli TG1,構(gòu)建犬瘟熱病毒單域抗體庫,得到庫容1.3×106。并將犬瘟熱病毒關(guān)鍵抗原蛋白H、F、N克隆到原核表達載體pET28a中,重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞BL21 (DE3)中,構(gòu)建好的表達質(zhì)粒對接下來進行的抗體庫篩選提供基礎(chǔ)。相應(yīng)單域抗體的制備,為治療犬瘟熱提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：犬瘟熱病毒 犬瘟熱病毒關(guān)鍵抗原 單域抗體 噬菌體展示技術(shù) 原核表達
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 縮略語表9-10
• 1 引言10-19
• 1.1 犬瘟熱的概述10-14
• 1.1.1 流行病學(xué)10-11
• 1.1.2 病原11
• 1.1.3 犬瘟熱H、F、N蛋白及其主要功能特點11-12
• 1.1.4 發(fā)病機理12
• 1.1.5 臨床癥狀12-13
• 1.1.6 病理變化13
• 1.1.7 診斷與防治13
• 1.1.8 犬瘟熱的治療現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢13-14
• 1.2 單域抗體14-15
• 1.2.1 抗體14
• 1.2.2 駱駝抗體14-15
• 1.3 噬菌體展示技術(shù)15
• 1.4 噬菌體抗體庫15-18
• 1.4.1 噬菌體抗體庫的基本原理16
• 1.4.2 噬菌體抗體庫的類型16-17
• 1.4.3 噬菌體抗體庫的特點與優(yōu)勢17
• 1.4.4 噬菌體抗體庫的發(fā)展17-18
• 1.5 研究目的和意義18-19
• 2 試驗一 抗犬瘟熱病毒單域抗體庫的構(gòu)建19-36
• 2.1 試驗材料19-21
• 2.1.1 試驗動物19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 PCR引物19-20
• 2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液的配制20-21
• 2.1.5 實驗儀器和設(shè)備21
• 2.2 試驗內(nèi)容和方法21-29
• 2.2.1 駱駝的免疫21-22
• 2.2.2 血清抗體效價的測定22
• 2.2.3 采集駱駝全血22
• 2.2.4 外周血淋巴細胞分離22-23
• 2.2.5 提取淋巴細胞總RNA23
• 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA23-24
• 2.2.7 單域抗體基因的擴增24-25
• 2.2.8 VHH片段的酶切和純化25-26
• 2.2.9 pCANTAB5E載體的制備26-27
• 2.2.10 VHH片段與pCANTAB5E載體連接27-28
• 2.2.11 電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG128-29
• 2.2.12 抗體庫的初步鑒定29
• 2.3 結(jié)果29-33
• 2.3.1 血清抗體效價ELISA測定29-30
• 2.3.2 VHH基因的擴增30-31
• 2.3.3 pCANTAB5E質(zhì)粒酶切31-32
• 2.3.4 抗體庫的鑒定32
• 2.3.5 序列分析32-33
• 2.4 討論33-35
• 2.5 小結(jié)35-36
• 3 試驗二 犬瘟熱病毒H、F、N基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建36-45
• 3.1 試驗材料36
• 3.1.1 試驗試劑36
• 3.1.2 引物36
• 3.1.3 試驗儀器36
• 3.2 試驗內(nèi)容和方法36-40
• 3.2.1 提取RNA36
• 3.2.2 擴增H、F、N基因片段36-37
• 3.2.3 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建37
• 3.2.4 表達質(zhì)粒的構(gòu)建37-40
• 3.3 結(jié)果40-43
• 3.3.1 H、F、N基因的擴增40
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的鑒定40-41
• 3.3.3 重組質(zhì)粒的酶切41
• 3.3.4 pET28a質(zhì)粒酶切41-42
• 3.3.5 表達質(zhì)粒的鑒定42-43
• 3.3.6 表達質(zhì)粒序列測定43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 4 結(jié)論45-46
• 致謝46-47
• 參考文獻47-51
• 作者簡介51

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本文編號：1085013