發(fā)布時間：2017-10-23 04:02

  本文關(guān)鍵詞：牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因篩選及初步分析

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【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)常引起牛出血性敗血癥、牛肺炎、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、山羊和綿羊肺炎等多種動物疾病,人類受到攜帶病原的動物咬傷或者抓傷也會引發(fā)感染。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜血清型的不同分為A、B、D、E和F 5種血清群,根據(jù)脂多糖抗原的不同分為16種血清型。自2008年我國首次分離到牛源A型多殺性巴氏桿菌以來,該病原常與其他病原菌繼發(fā)感染,在多地牛群中呈現(xiàn)流行性發(fā)生,感染該病菌的牛出現(xiàn)高發(fā)病率和死亡率,對養(yǎng)牛業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。多殺性巴氏桿菌根據(jù)其對宿主致病力的不同,分為強(qiáng)毒力菌株和弱毒力菌株,影響菌株毒力的主要因素是編碼毒力因子的毒力基因以及相關(guān)調(diào)控基因,強(qiáng)弱毒株基因組序列的比較可為菌株致病性研究提供許多有用信息,強(qiáng)毒株中存在,弱毒株中不存在的差異基因往往在細(xì)菌致病機(jī)理中占有重要作用。研究表明,毒力基因表達(dá)的蛋白作為抗原制備疫苗免疫動物,可以對機(jī)體起到免疫保護(hù)作用。抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)是目前應(yīng)用成熟的一種技術(shù),常用于致病菌與非致病菌差異基因篩選,將其基因組共同的部分去除,提煉更有價值的信息。本研究通過SSH技術(shù)對強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2和弱毒株P(guān)mCQ6基因組進(jìn)行消減雜交,試圖獲得可能具有致病性或調(diào)控毒力基因表達(dá)的候選基因序列片段;然后結(jié)合對強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果,篩選可能的差異基因候選分子,通過PCR擴(kuò)增驗(yàn)證并進(jìn)一步比對分析;最后對差異基因克隆表達(dá),選擇蛋白表達(dá)量高且反應(yīng)原性好的分子做初步研究。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:1、牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的SSH法篩選以本實(shí)驗(yàn)室保存的牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2和弱毒株P(guān)mCQ6為研究對象,利用抑制性消減雜交技術(shù)研究強(qiáng)弱毒株差異基因。結(jié)果表明:pmcq2和pmcq6基因組dna酶切完全,通過消減雜交富集了差異基因片段,成功構(gòu)建差減文庫并對其基因進(jìn)行t克隆,菌液pcr結(jié)果顯示117個陽性克隆獲得了插入片斷,測序和基因生物信息學(xué)分析后獲得28個差異基因,將差異基因按照編碼的蛋白功能不同分為五類:毒力因子相關(guān)蛋白、代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白、dna合成相關(guān)蛋白、其他相關(guān)蛋白。研究結(jié)果為牛源a型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的篩選以及致病性基因的深入探討奠定了分子基礎(chǔ)。2、牛源a型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析及pcr驗(yàn)證ssh法分析獲得的強(qiáng)弱毒株28個差異基因片段與牛源a型多殺性巴氏桿菌pmcq2株和pmcq6株的全基因組序列本地數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,得到1個只存在于pmcq2基因組的差異基因pmcq2-6g0023,編碼噬菌體尾巴蛋白,與弱毒株的對應(yīng)基因pmcq6-8g0001序列相比,pmcq2-6g0023基因缺失了30個堿基。根據(jù)公司對強(qiáng)弱毒株基因組生物信息學(xué)分析結(jié)果,從理論上得到46個差異基因,這些基因數(shù)量多且差異性還待進(jìn)一步驗(yàn)證。前期研究表明噬菌體相關(guān)基因在巴氏桿菌中常成簇存在,并且會影響菌株的致病力,推測pmcq2-6g0023的上下游基因以及與噬菌體相關(guān)的其他基因也存在差異性。本試驗(yàn)基于以上的研究和推測,參照公司分析得到的46個差異基因,從中篩選了7個噬菌體相關(guān)基因、1個pmcq2-6g0023上游基因pmcq2_6g0019、1個可能編碼毒力因子gp63或假定蛋白的基因pmcq2_6g0001等共9個基因,還有pmcq2-6g0023,分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增,驗(yàn)證其在強(qiáng)弱毒株中的差異性。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)室分離保存的強(qiáng)毒株pmcq2、pmcq1、pmcq3、pmcq4、pmcq5以及pmcq7與弱毒株pmcq6的差異基因共8個,分別是pmcq2_2g0233、pmcq2_2g0235、pmcq2_5g0023、pmcq2_6g0001、pmcq2_6g0006、pmcq2_6g0018、pmcq2_6g0019、pmcq2_6g0021。pmcq2-6g0023也可以從其他5個強(qiáng)毒株中擴(kuò)增得到。差異基因中編碼的蛋白注釋結(jié)果有7個與噬菌體相關(guān)(包括pmcq2-6g0023),證明了推測的正確性。3、牛源a型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因pmcq2-6g0018的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究選取以上研究獲得的9個差異基因以及pmcq6-8g0001,通過pcr克隆差異基因全長,分別插入原核表達(dá)載體pet-30a(+),經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,sds-page分析結(jié)果表明,4個重組目標(biāo)蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)且與預(yù)期分子大小一致。選擇其中蛋白注釋功能為噬菌體尾巴蛋白,且表達(dá)量高的rPmCQ2-6g0018和rPm CQ2-6g0021重組蛋白,大量誘導(dǎo)表達(dá)后,用Ni柱對目標(biāo)融合蛋白進(jìn)行純化,經(jīng)Western-blot分析發(fā)現(xiàn),重組蛋白rPmCQ2-6g0018分子量大小約19 KDa且具有良好的免疫活性。從轉(zhuǎn)錄水平分析基因PmCQ2-6g0018在體內(nèi)的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在16h時間點(diǎn),PmCQ2-6g0018在小鼠肺臟中相對表達(dá)量極顯著高于對照組。將純化蛋白rPmCQ2-6g0018和全菌蛋白分別免疫小鼠(免疫劑量為100μg/只),二免后2周收集抗血清,ELISA法檢測抗體水平,用2LD50 PmCQ2株(4.4í105cfu)對小鼠進(jìn)行腹腔攻毒保護(hù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示,rPmCQ2-6g0018蛋白免疫組抗體水平稍低于全菌蛋白免疫組,rPmCQ2-6g0018蛋白的免疫保護(hù)率為25%,全菌蛋白免疫保護(hù)率為100%。PmCQ2基因組中噬菌體尾巴蛋白相關(guān)基因的研究為牛源A型多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制的深入探討提供了參考。
【關(guān)鍵詞】：牛 多殺性巴氏桿菌 抑制性消減雜交 差異基因
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1.1 多殺性巴氏桿菌概述13-15
• 1.1.1 多殺性巴氏桿菌病原學(xué)和分類13-14
• 1.1.2 多殺性巴氏桿菌主要流行病學(xué)14
• 1.1.3 多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制14-15
• 1.2 多殺性巴氏桿菌毒力因子基因研究進(jìn)展15-19
• 1.2.1 多殺性巴氏桿菌毒素相關(guān)基因15-16
• 1.2.2 鐵調(diào)節(jié)和鐵捕獲蛋白相關(guān)基因16-17
• 1.2.3 莢膜相關(guān)基因17
• 1.2.4 脂多糖相關(guān)基因17-18
• 1.2.5 外膜蛋白相關(guān)基因18-19
• 1.3 噬菌體對細(xì)菌致病性的影響研究概況19-20
• 1.4 抑制性消減雜交技術(shù)在尋找新的致病性基因中的應(yīng)用20-23
• 第2章 引言23-25
• 2.1 研究目的與意義23
• 2.2 主要內(nèi)容23-24
• 2.3 技術(shù)路線24-25
• 第3章 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的SSH法篩選25-41
• 3.1 材料25-27
• 3.1.1 菌種25
• 3.1.2 試劑25
• 3.1.3 主要化學(xué)試劑的配制25-26
• 3.1.4 主要儀器26-27
• 3.2 方法27-35
• 3.2.1 差減文庫的構(gòu)建27-33
• 3.2.2 差減文庫的克隆33-34
• 3.2.3 菌液PCR篩選34-35
• 3.2.4 測序與同源性分析35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.3.1 差減文庫的構(gòu)建35-38
• 3.3.2 差減文庫的克隆及PCR鑒定38
• 3.3.3 測序與同源性分析38-39
• 3.4 討論39-41
• 第4章 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析及PCR驗(yàn)證41-49
• 4.1 材料41
• 4.1.1 菌種41
• 4.1.2 試劑41
• 4.1.3 生物信息分析軟件41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 SSH法篩選得到的28個差異基因生物信息學(xué)分析41-42
• 4.2.2 差異基因的進(jìn)一步篩選42
• 4.2.3 差異基因的PCR驗(yàn)證42-43
• 4.3 結(jié)果43-46
• 4.3.1 SSH法篩選得到的28個差異基因生物信息學(xué)分析43
• 4.3.2 差異基因的進(jìn)一步篩選結(jié)果43
• 4.3.3 差異基因的PCR驗(yàn)證43-46
• 4.4 討論46-49
• 第5章 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因PmCQ2-6g0018的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究49-65
• 5.1 材料49-51
• 5.1.1 菌種及實(shí)驗(yàn)動物49
• 5.1.2 試劑49
• 5.1.3 主要化學(xué)試劑配制49-51
• 5.1.4 主要儀器和生物信息學(xué)分析軟件51
• 5.2 方法51-58
• 5.2.1 差異基因的克隆表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性分析51-56
• 5.2.2 PmCQ2_6g0018基因體內(nèi)表達(dá)情況的分析56-57
• 5.2.3 動物保護(hù)性試驗(yàn)57-58
• 5.3 結(jié)果58-63
• 5.3.1 差異基因的克隆表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性分析58-61
• 5.3.2 PmCQ2_6g0018基因體內(nèi)表達(dá)情況的分析結(jié)果61-62
• 5.3.3 ELISA檢測抗體水平62-63
• 5.3.4 動物保護(hù)性試驗(yàn)結(jié)果63
• 5.4 討論63-65
• 第6章 結(jié)論65-67
• 6.1 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的SSH法篩選65
• 6.2 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因的生物信息學(xué)分析及PCR驗(yàn)證65
• 6.3 牛源A型多殺性巴氏桿菌強(qiáng)弱毒株差異基因PmCQ2_6g0018的表達(dá)及其免疫保護(hù)性研究65-67
• 參考文獻(xiàn)67-73
• 附錄73-77
• 致謝77-79
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文及參加科研項(xiàng)目79

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