本文關鍵詞：以CotB為分子載體表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢的研究

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【摘要】：本研究將豬流行性腹瀉病毒(PEDV) S蛋白COE1保護性抗原片段與枯草桿菌芽孢衣殼蛋白CotB基因進行融合,通過同源雙交叉構建表面展示S蛋白COE1保護性抗原片段的枯草桿菌重組芽孢。以小鼠為動物模型,通過灌胃及拌料方式給予重組芽孢,觀察重組芽孢對小鼠的免疫反應及部分微生態(tài)益生效應,以期依靠枯草桿菌天然的益生作用結合PEDV保護性抗原表位刺激的特異性黏膜免疫反應,用于預防豬流性型腹瀉病以降低其對畜牧業(yè)帶來的影響。試驗內容與結果如下：(1)本試驗參考PEDV S蛋白抗原表位現(xiàn)有研究,選擇PEDV S基因的保護性抗原片段(COE1),通過枯草桿菌穿梭整合質粒pDG364分別將目的片段CotB、COE1依次連接到質粒pDG364多克隆位點,構建重組質粒pDG364-CotB-COE,。對重組質粒分別進行PCR、雙酶切及測序鑒定,結果表明CotB、COE1基因片段成功地載入質粒pDG364多克隆位點,成功構建重組質粒pDG364-CotB-COE1。(2)重組質粒pDG364與枯草桿菌染色體通過同源雙交叉,使得CotB-COE1重組于枯草桿菌染色體,構建重組枯草芽孢桿菌(PBE)。通過淀粉酶活性分析與PCR鑒定,結果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草桿菌染色體；Western-blot分析結果在67.78kDa處獲得一條特異性蛋白條帶,表明融合基序CotB-COE1獲得了表達；使用生物素標記抗體進行免疫熒光顯微鏡觀察,重組芽孢具有特異性熒光信號,結果表明PEDVS蛋白的COE1保護性抗原片段成功地在枯草桿菌芽孢表面獲得表達。(3)選用ICR雌性小鼠120只,隨機平均分成5組,即枯草桿菌重組芽孢灌胃組(gb)、枯草桿菌重組芽孢拌料組(bb)、野生型枯草桿菌168芽孢灌胃組(g1)、野生型枯草桿菌168芽孢拌料組(b1)、PBS對照組(K)。g1與gb組小鼠每次每只灌服芽孢懸液100μ1(芽孢量為1.0×1010CFU); b1與bb組則以拌料飼喂的方式給予小鼠芽孢,飼料含芽孢量為1.0×106CFU/g; K組為PBS對照組,僅飼喂基礎日糧。采集血液、小腸內容物,測定血清中抗PEDV特異性IgG抗體水平及小腸內容物中sIgA抗體水平。結果表明,重組芽孢灌胃或拌料組小鼠血清及小腸內容物中均檢測到PEDV特異性抗體,且各組在21d后可檢測到明顯的抗體水平,第35d抗體水平達到最高峰,至49天仍能檢測到較高水平的抗體：重組芽孢灌胃或拌料組與野生型芽孢灌胃或拌料組、對照組抗體水平相比,差異極顯著(P0.01);另重組芽孢拌料組所誘導的血清IgG與腸粘膜sIgA抗體水平均高于灌胃組,但差異不顯著(P0.05)。(4)采用MTT法檢測脾細胞增殖及采用ELISA檢測IL-4、IFN-γ分泌情況。結果,各組間小鼠脾細胞增殖刺激指數(shù)(SI)差異不顯著(P0.05)：重組芽孢灌胃組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢灌胃組、對照組(P0.01)；重組芽孢拌料組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢拌料組和PBS對照組(P0.01),重組芽孢拌料組IL-4水平極顯著高于重組芽孢灌胃組(P0.01),但重組芽孢灌胃組所分泌IFN-γ水平則略高于重組芽孢拌料組(P0.05)。(5)對試驗49d小鼠盲腸內容物進行活菌計數(shù)及PCR-DGGE分析。結果表明,枯草桿菌重組芽孢灌胃或拌料組較對照組增重顯著(p0.05),其中灌胃組增重略低于拌料組,但各組間差異不顯著(p0.05);對照組盲腸內容物中大腸桿菌數(shù)量較其它組高,灌胃、拌料重組與非重組芽孢組盲腸內容物中乳酸桿菌數(shù)量則明顯高于對照組；PCR-DGGE分析顯示飼喂枯草桿菌芽孢組小鼠盲腸內菌群數(shù)量和密度均得到增加。各組間胸腺指數(shù)差異不顯著(p0.05),重組芽孢組小鼠脾臟指數(shù)極顯著高于野生型芽孢組、對照組(p0.01)；綜上所述,本試驗成功地將豬流行性腹瀉病毒的S蛋白保護性抗原片段COE1整合于枯草芽孢桿菌基因組。經免疫熒光顯微鏡觀察及Western-Blot鑒定枯草桿菌重組芽孢具有較好的免疫原性。動物試驗結果表明枯草桿菌重組芽孢可誘導小鼠產生一定水平的抗豬流行性腹瀉病毒的體液免疫反應和細胞免疫反應。另枯草桿菌重組芽孢能促進小鼠生長,提高盲腸優(yōu)勢菌群數(shù)量,增加腸道菌群結構的多樣性、豐度和菌群的穩(wěn)定性,提高脾臟指數(shù)。
【關鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 枯草芽孢桿菌 芽孢表面展示 免疫 微生態(tài)學
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略語表9-13
• 第一章 文獻綜述13-18
• 1 豬流行性腹瀉病毒及其疫苗的研究13-15
• 1.1 豬流行性腹瀉的流行與危害13
• 1.2 豬流行性腹瀉病毒的研究13-14
• 1.3 豬流行性腹瀉病毒抗原表位的研究14
• 1.4 豬流行性腹瀉病毒疫苗的研究14-15
• 2 枯草桿菌芽孢表面展示技術15-17
• 2.1 枯草桿菌芽孢15-16
• 2.2 枯草桿菌芽孢作為疫苗載體的研究16-17
• 3 本研究的選題意義17-18
• 第二章 構建表面展示PEDV S蛋白保護性抗原片段的枯草桿菌重組芽孢18-34
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒18
• 1.2 菌株及質粒18
• 1.3 試劑及溶液18-19
• 1.4 培養(yǎng)基19-20
• 1.5 試驗儀器20
• 2 方法20-27
• 2.1 目的片段的擴增20-22
• 2.1.1 引物設計20-21
• 2.1.2 基因組提取21
• 2.1.3 PCR擴增目的片段21-22
• 2.2 重組質粒pDG364-CotB-COE_1的構建22-24
• 2.2.1 目的片段與T載體的連接22
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備22
• 2.2.3 連接產物的轉化22-23
• 2.2.4 重組質粒pDG364-CotB-COE_1的構建23-24
• 2.3 重組枯草芽孢桿菌的構建24
• 2.3.1 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細胞的制備24
• 2.3.2 重組質粒pDG364-CotB-COE1的轉化24
• 2.4 重組枯草芽孢桿菌的鑒定篩選24-25
• 2.4.1 重組枯草芽孢桿菌的淀粉酶活性鑒定24
• 2.4.2 重組枯草芽孢桿菌PCR及測序鑒定24-25
• 2.5 枯草桿菌重組芽孢的鑒定與觀察25-27
• 2.5.1 枯草桿菌芽孢的制備25
• 2.5.2 枯草芽孢桿菌芽孢的純化25
• 2.5.3 枯草桿菌重組芽孢衣殼總蛋白western-blot分析25-26
• 2.5.4 枯草桿菌重組芽孢免疫顯微鏡觀察26-27
• 3. 試驗結果27-32
• 3.1 目的基因的擴增27-28
• 3.2 重組質粒pDG364-CotB-COE1的鑒定28-29
• 3.3 重組枯草芽孢桿菌淀粉酶活性鑒定29
• 3.4 重組枯草芽孢桿菌PCR鑒定29-31
• 3.5 重組芽孢Western-blot及免疫熒光顯微鏡分析31-32
• 4 討論32-34
• 第三章 表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢對小鼠免疫效果研究34-42
• 1 材料34
• 1.1 病毒與菌株34
• 1.2 試劑與溶液34
• 1.2.1 試劑34
• 1.2.2 ELISA檢測所需溶液的配制34
• 1.3 培養(yǎng)基34
• 2 方法34-37
• 2.2 動物飼養(yǎng)管理34-35
• 2.3 動物分組35
• 2.4 樣品的采集35
• 2.5 血清IgG與腸內容物sIgA抗體水平間接ELISA檢測35-36
• 2.6 脾淋巴細胞增殖36-37
• 2.6.1 小鼠淋巴細胞的制備36
• 2.6.2 淋巴細胞增殖試驗36-37
• 2.7 淋巴細胞因子檢測37
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計37
• 3. 結果37-40
• 3.1 間接ELISA抗體水平檢測37-38
• 3.1.1 血清特異性IgG抗體水平檢測結果37-38
• 3.1.2 小鼠小腸內容物中特異性sIgA檢測結果38
• 3.2 淋巴細胞增殖試驗38-39
• 3.3 淋巴細胞因子測定結果39-40
• 4. 討論40-42
• 第四章 重組枯草桿菌PBE芽孢對小鼠生長、盲腸菌群及免疫器官指數(shù)的影響42-50
• 1 材料42
• 1.1 試劑及儀器42
• 1.2 培養(yǎng)基42
• 2 方法42-44
• 2.1 小鼠生長性能測定42-43
• 2.2 小鼠盲腸菌群的活菌計數(shù)43
• 2.2.1 盲腸內容物樣品處理43
• 2.2.2 培養(yǎng)與計數(shù)43
• 2.3 PCR-DGGE檢測小鼠盲腸菌群結構變化43-44
• 2.3.1 細菌總DNA提取43
• 2.3.2 基因組總DNA16S rDNA V3區(qū)擴增43
• 2.3.3 擴增片段的變性梯度凝膠電泳43-44
• 2.3.4 條帶的回收及克隆測序44
• 2.4 免疫器官指數(shù)檢測44
• 2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計44
• 3 結果與分析44-48
• 3.1 重組芽孢對小鼠增重的影響44-45
• 3.2 小鼠盲腸菌群數(shù)量變化45
• 3.3 小鼠腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜45-46
• 3.4 PCR-DGGE檢測小鼠腸道菌群多樣性46-47
• 3.5 小鼠腸道特異性菌群和共性菌群分析47
• 3.6 重組芽孢對小鼠免疫器官的影響47-48
• 4 討論48-50
• 第五章 結論50-51
• 參考文獻51-57
• 致謝57-58
• 附錄58-63
• 在讀期間發(fā)表的學術論文63

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 戴茜茜;以CotB為分子載體表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢的研究[D];四川農業(yè)大學;2016年

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本文編號：1077610