本文關(guān)鍵詞：以CotB為分子載體表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢的研究

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【摘要】：本研究將豬流行性腹瀉病毒(PEDV) S蛋白COE1保護(hù)性抗原片段與枯草桿菌芽孢衣殼蛋白CotB基因進(jìn)行融合,通過同源雙交叉構(gòu)建表面展示S蛋白COE1保護(hù)性抗原片段的枯草桿菌重組芽孢。以小鼠為動(dòng)物模型,通過灌胃及拌料方式給予重組芽孢,觀察重組芽孢對(duì)小鼠的免疫反應(yīng)及部分微生態(tài)益生效應(yīng),以期依靠枯草桿菌天然的益生作用結(jié)合PEDV保護(hù)性抗原表位刺激的特異性黏膜免疫反應(yīng),用于預(yù)防豬流性型腹瀉病以降低其對(duì)畜牧業(yè)帶來的影響。試驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下：(1)本試驗(yàn)參考PEDV S蛋白抗原表位現(xiàn)有研究,選擇PEDV S基因的保護(hù)性抗原片段(COE1),通過枯草桿菌穿梭整合質(zhì)粒pDG364分別將目的片段CotB、COE1依次連接到質(zhì)粒pDG364多克隆位點(diǎn),構(gòu)建重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE,。對(duì)重組質(zhì)粒分別進(jìn)行PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定,結(jié)果表明CotB、COE1基因片段成功地載入質(zhì)粒pDG364多克隆位點(diǎn),成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE1。(2)重組質(zhì)粒pDG364與枯草桿菌染色體通過同源雙交叉,使得CotB-COE1重組于枯草桿菌染色體,構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌(PBE)。通過淀粉酶活性分析與PCR鑒定,結(jié)果表明CotB-COE1融合基序成功整合于枯草桿菌染色體；Western-blot分析結(jié)果在67.78kDa處獲得一條特異性蛋白條帶,表明融合基序CotB-COE1獲得了表達(dá)；使用生物素標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫熒光顯微鏡觀察,重組芽孢具有特異性熒光信號(hào),結(jié)果表明PEDVS蛋白的COE1保護(hù)性抗原片段成功地在枯草桿菌芽孢表面獲得表達(dá)。(3)選用ICR雌性小鼠120只,隨機(jī)平均分成5組,即枯草桿菌重組芽孢灌胃組(gb)、枯草桿菌重組芽孢拌料組(bb)、野生型枯草桿菌168芽孢灌胃組(g1)、野生型枯草桿菌168芽孢拌料組(b1)、PBS對(duì)照組(K)。g1與gb組小鼠每次每只灌服芽孢懸液100μ1(芽孢量為1.0×1010CFU); b1與bb組則以拌料飼喂的方式給予小鼠芽孢,飼料含芽孢量為1.0×106CFU/g; K組為PBS對(duì)照組,僅飼喂基礎(chǔ)日糧。采集血液、小腸內(nèi)容物,測(cè)定血清中抗PEDV特異性IgG抗體水平及小腸內(nèi)容物中sIgA抗體水平。結(jié)果表明,重組芽孢灌胃或拌料組小鼠血清及小腸內(nèi)容物中均檢測(cè)到PEDV特異性抗體,且各組在21d后可檢測(cè)到明顯的抗體水平,第35d抗體水平達(dá)到最高峰,至49天仍能檢測(cè)到較高水平的抗體：重組芽孢灌胃或拌料組與野生型芽孢灌胃或拌料組、對(duì)照組抗體水平相比,差異極顯著(P0.01);另重組芽孢拌料組所誘導(dǎo)的血清IgG與腸粘膜sIgA抗體水平均高于灌胃組,但差異不顯著(P0.05)。(4)采用MTT法檢測(cè)脾細(xì)胞增殖及采用ELISA檢測(cè)IL-4、IFN-γ分泌情況。結(jié)果,各組間小鼠脾細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(SI)差異不顯著(P0.05)：重組芽孢灌胃組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢灌胃組、對(duì)照組(P0.01)；重組芽孢拌料組IL-4和IFN-γ水平極顯著高于野生型芽孢拌料組和PBS對(duì)照組(P0.01),重組芽孢拌料組IL-4水平極顯著高于重組芽孢灌胃組(P0.01),但重組芽孢灌胃組所分泌IFN-γ水平則略高于重組芽孢拌料組(P0.05)。(5)對(duì)試驗(yàn)49d小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)及PCR-DGGE分析。結(jié)果表明,枯草桿菌重組芽孢灌胃或拌料組較對(duì)照組增重顯著(p0.05),其中灌胃組增重略低于拌料組,但各組間差異不顯著(p0.05);對(duì)照組盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量較其它組高,灌胃、拌料重組與非重組芽孢組盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量則明顯高于對(duì)照組；PCR-DGGE分析顯示飼喂枯草桿菌芽孢組小鼠盲腸內(nèi)菌群數(shù)量和密度均得到增加。各組間胸腺指數(shù)差異不顯著(p0.05),重組芽孢組小鼠脾臟指數(shù)極顯著高于野生型芽孢組、對(duì)照組(p0.01)；綜上所述,本試驗(yàn)成功地將豬流行性腹瀉病毒的S蛋白保護(hù)性抗原片段COE1整合于枯草芽孢桿菌基因組。經(jīng)免疫熒光顯微鏡觀察及Western-Blot鑒定枯草桿菌重組芽孢具有較好的免疫原性。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明枯草桿菌重組芽孢可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗豬流行性腹瀉病毒的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。另枯草桿菌重組芽孢能促進(jìn)小鼠生長(zhǎng),提高盲腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量,增加腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性、豐度和菌群的穩(wěn)定性,提高脾臟指數(shù)。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 枯草芽孢桿菌 芽孢表面展示 免疫 微生態(tài)學(xué)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略語(yǔ)表9-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-18
• 1 豬流行性腹瀉病毒及其疫苗的研究13-15
• 1.1 豬流行性腹瀉的流行與危害13
• 1.2 豬流行性腹瀉病毒的研究13-14
• 1.3 豬流行性腹瀉病毒抗原表位的研究14
• 1.4 豬流行性腹瀉病毒疫苗的研究14-15
• 2 枯草桿菌芽孢表面展示技術(shù)15-17
• 2.1 枯草桿菌芽孢15-16
• 2.2 枯草桿菌芽孢作為疫苗載體的研究16-17
• 3 本研究的選題意義17-18
• 第二章 構(gòu)建表面展示PEDV S蛋白保護(hù)性抗原片段的枯草桿菌重組芽孢18-34
• 1 材料18-20
• 1.1 病毒18
• 1.2 菌株及質(zhì)粒18
• 1.3 試劑及溶液18-19
• 1.4 培養(yǎng)基19-20
• 1.5 試驗(yàn)儀器20
• 2 方法20-27
• 2.1 目的片段的擴(kuò)增20-22
• 2.1.1 引物設(shè)計(jì)20-21
• 2.1.2 基因組提取21
• 2.1.3 PCR擴(kuò)增目的片段21-22
• 2.2 重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE_1的構(gòu)建22-24
• 2.2.1 目的片段與T載體的連接22
• 2.2.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備22
• 2.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化22-23
• 2.2.4 重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE_1的構(gòu)建23-24
• 2.3 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建24
• 2.3.1 枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備24
• 2.3.2 重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE1的轉(zhuǎn)化24
• 2.4 重組枯草芽孢桿菌的鑒定篩選24-25
• 2.4.1 重組枯草芽孢桿菌的淀粉酶活性鑒定24
• 2.4.2 重組枯草芽孢桿菌PCR及測(cè)序鑒定24-25
• 2.5 枯草桿菌重組芽孢的鑒定與觀察25-27
• 2.5.1 枯草桿菌芽孢的制備25
• 2.5.2 枯草芽孢桿菌芽孢的純化25
• 2.5.3 枯草桿菌重組芽孢衣殼總蛋白western-blot分析25-26
• 2.5.4 枯草桿菌重組芽孢免疫顯微鏡觀察26-27
• 3. 試驗(yàn)結(jié)果27-32
• 3.1 目的基因的擴(kuò)增27-28
• 3.2 重組質(zhì)粒pDG364-CotB-COE1的鑒定28-29
• 3.3 重組枯草芽孢桿菌淀粉酶活性鑒定29
• 3.4 重組枯草芽孢桿菌PCR鑒定29-31
• 3.5 重組芽孢Western-blot及免疫熒光顯微鏡分析31-32
• 4 討論32-34
• 第三章 表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢對(duì)小鼠免疫效果研究34-42
• 1 材料34
• 1.1 病毒與菌株34
• 1.2 試劑與溶液34
• 1.2.1 試劑34
• 1.2.2 ELISA檢測(cè)所需溶液的配制34
• 1.3 培養(yǎng)基34
• 2 方法34-37
• 2.2 動(dòng)物飼養(yǎng)管理34-35
• 2.3 動(dòng)物分組35
• 2.4 樣品的采集35
• 2.5 血清IgG與腸內(nèi)容物sIgA抗體水平間接ELISA檢測(cè)35-36
• 2.6 脾淋巴細(xì)胞增殖36-37
• 2.6.1 小鼠淋巴細(xì)胞的制備36
• 2.6.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)36-37
• 2.7 淋巴細(xì)胞因子檢測(cè)37
• 2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)37
• 3. 結(jié)果37-40
• 3.1 間接ELISA抗體水平檢測(cè)37-38
• 3.1.1 血清特異性IgG抗體水平檢測(cè)結(jié)果37-38
• 3.1.2 小鼠小腸內(nèi)容物中特異性sIgA檢測(cè)結(jié)果38
• 3.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)38-39
• 3.3 淋巴細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果39-40
• 4. 討論40-42
• 第四章 重組枯草桿菌PBE芽孢對(duì)小鼠生長(zhǎng)、盲腸菌群及免疫器官指數(shù)的影響42-50
• 1 材料42
• 1.1 試劑及儀器42
• 1.2 培養(yǎng)基42
• 2 方法42-44
• 2.1 小鼠生長(zhǎng)性能測(cè)定42-43
• 2.2 小鼠盲腸菌群的活菌計(jì)數(shù)43
• 2.2.1 盲腸內(nèi)容物樣品處理43
• 2.2.2 培養(yǎng)與計(jì)數(shù)43
• 2.3 PCR-DGGE檢測(cè)小鼠盲腸菌群結(jié)構(gòu)變化43-44
• 2.3.1 細(xì)菌總DNA提取43
• 2.3.2 基因組總DNA16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增43
• 2.3.3 擴(kuò)增片段的變性梯度凝膠電泳43-44
• 2.3.4 條帶的回收及克隆測(cè)序44
• 2.4 免疫器官指數(shù)檢測(cè)44
• 2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)44
• 3 結(jié)果與分析44-48
• 3.1 重組芽孢對(duì)小鼠增重的影響44-45
• 3.2 小鼠盲腸菌群數(shù)量變化45
• 3.3 小鼠腸道菌群PCR-DGGE指紋圖譜45-46
• 3.4 PCR-DGGE檢測(cè)小鼠腸道菌群多樣性46-47
• 3.5 小鼠腸道特異性菌群和共性菌群分析47
• 3.6 重組芽孢對(duì)小鼠免疫器官的影響47-48
• 4 討論48-50
• 第五章 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 致謝57-58
• 附錄58-63
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63

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1 戴茜茜;以CotB為分子載體表面展示PEDV S蛋白抗原片段的枯草桿菌重組芽孢的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1077610