本文關(guān)鍵詞：ESD蛋白增強(qiáng)Ⅰ型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制口蹄疫病毒的復(fù)制

  更多相關(guān)文章： 口蹄疫病毒 酯酶D 干擾素相關(guān)因子 干擾素刺激基因 抗病毒應(yīng)答反應(yīng)

【摘要】：口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染PK-15細(xì)胞后,其復(fù)制產(chǎn)生的正鏈RNA能夠被細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體MDA5識(shí)別。MDA5招募下游接頭蛋白VISA,VISA不僅能夠與TRAF6相互作用,通過(guò)IKK復(fù)合物磷酸化修飾I?B?,使其與NF-?B分離后被降解,NF-?B轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中;VISA而且能夠招募MITA,與蛋白激酶TBK1相互作用,從而磷酸化修飾IRF3,磷酸化的IRF3通過(guò)形成二聚體,從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。進(jìn)入細(xì)胞核的NF-?B和IRF3誘導(dǎo)細(xì)胞中I型干擾素(IFNs)和多種ISGs等抗病毒因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),引起抗病毒天然免疫反應(yīng)。ESD的酶活性與很多疾病的發(fā)生密切相關(guān),然而,ESD參與調(diào)控天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)揮抗病毒作用的機(jī)制目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。課題組前期轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)結(jié)果表明,FMDV感染PK-15細(xì)胞后,ESD的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)顯著上調(diào),表明ESD與FMDV的感染存在一定關(guān)聯(lián)。在本研究中,我們通過(guò)病毒感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著FMDV在PK-15細(xì)胞中感染時(shí)間的延伸,ESD的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著上調(diào)。我們進(jìn)一步擴(kuò)增了豬的ESD基因,構(gòu)建了豬ESD基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。在PK-15細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ESD蛋白后接種FMDV,發(fā)現(xiàn)FMDV的復(fù)制水平顯著下降,且呈劑量依賴性。同時(shí)借助siRNA干擾技術(shù),下調(diào)表達(dá)PK-15細(xì)胞中的內(nèi)源性ESD蛋白,然后接種FMDV,發(fā)現(xiàn)FMDV的復(fù)制水平顯著上升。通過(guò)過(guò)表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了ESD能夠抑制FMDV的復(fù)制。為了進(jìn)一步探究ESD抑制FMDV復(fù)制的分子機(jī)制,我們檢測(cè)了病毒感染過(guò)程中ESD蛋白對(duì)I型干擾素信號(hào)通路下游多個(gè)抗病毒干擾素刺激基因(ISGs)表達(dá)的影響,結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)ESD,FMDV誘導(dǎo)的ISG15,MX1,ISG54,RIG-I,PKR和GBP1的mRNA表達(dá)水平也呈相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)變化。為探究ESD是否能夠調(diào)控I型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),我們開(kāi)展了IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)ESD能夠促進(jìn)SeV誘導(dǎo)的IFN-β的激活,并呈劑量依賴性。為進(jìn)一步揭示ESD如何調(diào)控I型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),我們開(kāi)展了I型干擾素通路分子過(guò)表達(dá)激活I(lǐng)FN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明ESD能夠提高IRF3以及它的上游信號(hào)分子(RIG-I-CARD,MDA5,VISA和TBK1)誘導(dǎo)的IFN-β的激活,但不影響IRF7誘導(dǎo)的IFN-β的激活,因此,我們推測(cè)ESD可能通過(guò)靶向IRF3來(lái)增強(qiáng)I型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為證實(shí)ESD是否影響IRF3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),我們又從蛋白水平上分別檢測(cè)了MDA5,VISA,TBK1,p-TBK1,IRF3,p-IRF3和病毒蛋白表達(dá)變化,結(jié)果表明:過(guò)表達(dá)ESD后,VISA,TBK1和IRF3表達(dá)水平變化不明顯,p-IRF3表達(dá)水平升高,FMDV復(fù)制水平下降;下調(diào)表達(dá)ESD后,VISA,TBK1和IRF3表達(dá)水平變化不明顯,p-IRF3表達(dá)水平減少,FMDV復(fù)制水平上升。這些結(jié)果表明ESD蛋白通過(guò)增強(qiáng)IRF3的磷酸化水平來(lái)促進(jìn)I型干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而發(fā)揮抗病毒作用�？傊�,通過(guò)本研究的開(kāi)展,我們首次揭示了ESD蛋白能夠發(fā)揮抗病毒作用。證實(shí)了ESD蛋白能夠增強(qiáng)IRF3的磷酸化水平,促進(jìn)FMDV誘導(dǎo)的I型干擾素信號(hào)通路的活化,誘導(dǎo)多種ISGs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而抑制FMDV在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：口蹄疫病毒 酯酶D 干擾素相關(guān)因子 干擾素刺激基因 抗病毒應(yīng)答反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 口蹄疫概述11-13
• 1.2 天然免疫概述13-16
• 1.3 口蹄疫病毒與天然免疫關(guān)系的研究16
• 1.4 ESD蛋白的研究進(jìn)展16-17
• 1.5 研究目的及意義17-18
• 第二章 豬ESD基因的擴(kuò)增及其與FMDV復(fù)制關(guān)系的研究18-33
• 2.1 前言18
• 2.2 材料18-20
• 2.2.1 質(zhì)粒，毒株，細(xì)胞系及抗體18
• 2.2.2 試劑及溶液配制18-20
• 2.2.3 試驗(yàn)器材20
• 2.3 方法20-26
• 2.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建20-23
• 2.3.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和接毒23-24
• 2.3.3 siRNA干擾技術(shù)24
• 2.3.4 FMDV滴度的測(cè)定24-25
• 2.3.5 Western blotting檢測(cè)25-26
• 2.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR? Green法）檢測(cè)26
• 2.3.7 數(shù)據(jù)分析26
• 2.4 結(jié)果26-31
• 2.4.1 Myc-ESD重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其驗(yàn)證表達(dá)26-28
• 2.4.2 ESD siRNA干擾效果28
• 2.4.3 ESD在口蹄疫病毒復(fù)制中上調(diào)表達(dá)28-29
• 2.4.4 過(guò)表達(dá)ESD顯著抑制FMDV在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制29-30
• 2.4.5 下調(diào)表達(dá)ESD顯著促進(jìn)FMDV在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制30-31
• 2.5 討論31-33
• 第三章 ESD抑制FMDV復(fù)制的分子機(jī)制研究33-43
• 3.1 前言33
• 3.2 材料33-34
• 3.2.1 質(zhì)粒，毒株，，細(xì)胞系及抗體33
• 3.2.2 試劑及溶液配制33-34
• 3.2.3 試驗(yàn)器材34
• 3.3 方法34-35
• 3.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR? Green法）檢測(cè)34-35
• 3.3.2 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)35
• 3.3.3 其他試驗(yàn)方法檢測(cè)35
• 3.3.4 數(shù)據(jù)分析35
• 3.4 結(jié)果35-41
• 3.4.1 ESD調(diào)控FMDV誘導(dǎo)的ISGs的表達(dá)35-38
• 3.4.2 ESD正調(diào)控SeV誘導(dǎo)的IFN-β的活化38
• 3.4.3 ESD通過(guò)靶向IRF3來(lái)增強(qiáng)IFN-β的活化38-39
• 3.4.4 ESD通過(guò)調(diào)控IRF3的磷酸化水平來(lái)影響FMDV的復(fù)制39-41
• 3.5 討論41-43
• 第四章 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 致謝50-51
• 作者簡(jiǎn)歷51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 孫輝;蔣爭(zhēng)凡;;抗病毒天然免疫研究[J];中國(guó)科學(xué):生命科學(xué);2013年10期

本文編號(hào)：1077025