本文關(guān)鍵詞：重組高產(chǎn)H1N1亞型豬流感滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià)

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【摘要】：豬流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)屬于正粘病毒科A型流感病毒屬的分節(jié)段、負(fù)鏈RNA病毒,是引起豬呼吸道疾病的一種重要病原體。世界上豬群中流行的主要亞型為H1N1、H1N2和H3N2,其中歐洲禽源H1N1亞型和古典H1N1亞型SIV是國內(nèi)主要的流行株。研究表明古典H1N1亞型SIV演化成為重組病毒并引發(fā)2009年人群中出現(xiàn)流感大流行,而在歐洲和亞洲也出現(xiàn)了關(guān)于歐洲禽源H1N1亞型SIV感染人的報(bào)道。因此防控SIV在豬群中傳播具有重要意義,同樣對(duì)指導(dǎo)和防控人及禽的流感病毒起到積極的輔助作用。本研究以國內(nèi)流行的歐洲禽源H1N1亞型SIV(A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1),簡稱SH1)為試驗(yàn)材料,RT-PCR擴(kuò)增HA和NA基因并插入至PBD載體中,構(gòu)建HA和NA基因的重組質(zhì)粒。將HA、NA重組質(zhì)粒及來源于流感病毒高產(chǎn)株P(guān)R8的6個(gè)內(nèi)部基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,成功拯救了重組歐亞禽源H1N1亞型SIV疫苗候選株(SH1/PR8)。MDCK細(xì)胞病毒生長曲線繪制結(jié)果表明,相對(duì)于原始毒株,重組病毒具有更高的病毒滴度:SH1/PR8以0.001MOI的劑量接種MDCK細(xì)胞48h后,病毒滴度最高且效價(jià)達(dá)到1×108TCID50/ml,血凝效價(jià)達(dá)到29,而原始毒株SH1的滴度為106TCID50/ml,血凝效價(jià)為27。病毒蝕斑試驗(yàn)結(jié)果也顯示,重組病毒SH1/PR8形成的病毒蝕斑比原始毒株SH大,在MDCK細(xì)胞上具有更強(qiáng)的復(fù)制能力。前期本實(shí)驗(yàn)室以古典H1N1亞型SIV(A/swine/Guangdong/1/2011(H1N1)簡稱G11)為材料,成功構(gòu)建了重組病毒G11/PR8,本研究MDCK細(xì)胞病毒生長曲線繪制結(jié)果顯示,重組病毒G11/PR8的病毒滴度達(dá)到2×108TCID50,血凝效價(jià)達(dá)到210,相對(duì)于原始病毒G11同樣具有更強(qiáng)的復(fù)制能力。將重組病毒SH1/PR8添加油乳佐劑制備成歐洲禽源H1N1亞型豬流感單價(jià)滅活疫苗,在小鼠和豬體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)效力的評(píng)價(jià)。小鼠體內(nèi)抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,免疫4周后HI抗體、中和抗體和IgG抗體效價(jià)持續(xù)升高,第4周達(dá)到最高的抗體效價(jià)。攻毒后小鼠體重變化和存活率試驗(yàn)結(jié)果表明,免疫組體重未明顯下降且存活率為100%,而非免疫組小鼠體重持續(xù)下降至70%且攻毒6天后死亡率為100%。攻毒后肺臟組織病毒含量檢測(cè)和病理學(xué)觀察結(jié)果顯示,免疫滅活疫苗能夠有效抑制SH1病毒在肺臟中的復(fù)制,減輕肺臟病理變化。同樣重組滅活疫苗免疫也能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生較高的抗體效價(jià),通過檢測(cè)攻毒后第5天豬鼻拭子、鼻甲骨和肺泡灌洗液中病毒的含量,結(jié)果顯示免疫疫苗組都未檢測(cè)到病毒肺臟的病變觀察和組織病理檢測(cè)也顯示免疫滅活疫苗能顯著降低病毒對(duì)豬肺臟的損傷。將重組病毒SH1/PR8和G11/PR8添加油乳佐劑制備成歐洲禽源和古典H1N1亞型豬流感二價(jià)滅活疫苗,在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)效力評(píng)價(jià),結(jié)果顯示,二價(jià)重組滅活疫苗能誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生較高的針對(duì)歐洲禽源和古典H1N1亞型SIV的HI抗體、中和抗體和IgG抗體效價(jià),能對(duì)兩種病毒的攻擊提供有效的免疫保護(hù)。單價(jià)疫苗能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的針對(duì)同源病毒的抗體并產(chǎn)生良好免疫保護(hù)效果,但不能夠抑制異源病毒在小鼠肺臟中復(fù)制,對(duì)異源病毒的攻擊不能提供有效的免疫保護(hù),小鼠體重持續(xù)下降,存活率為66.7%。以上結(jié)果表明,免疫二價(jià)滅活疫苗可針對(duì)歐亞禽源和古典H1N1亞型SIV攻擊提供良好的免疫保護(hù),而免疫單價(jià)滅活疫苗提供的交叉免疫保護(hù)作用較弱,只能提供部分的免疫保護(hù)。
【關(guān)鍵詞】：豬流感病毒 H1N1亞型 重組滅活疫苗 交叉免疫保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-26
• 1.1 豬流感15-19
• 1.1.1 豬流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.2 豬流感病毒基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白的功能16-17
• 1.1.3 豬流感病毒遺傳演化17
• 1.1.4 古典H1N1亞型流感病毒17
• 1.1.5 禽源H1N1亞型流感病毒17-18
• 1.1.6 重組的H3N2、H1N2和H1N1亞型流感病毒18-19
• 1.2 豬流感疫苗概況19-24
• 1.2.1 滅活疫苗19-20
• 1.2.2 弱毒疫苗20-21
• 1.2.3 亞單位疫苗21-22
• 1.2.4 活載體疫苗22
• 1.2.5 核酸疫苗22-23
• 1.2.6 通用型疫苗23-24
• 1.3 培養(yǎng)制備流感疫苗概況24-26
• 1.3.1 雞胚培養(yǎng)24
• 1.3.2 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 1.3.3 Vero細(xì)胞培養(yǎng)25-26
• 2 材料與方法26-46
• 2.1 試驗(yàn)材料26-28
• 2.1.1 毒株和質(zhì)粒26
• 2.1.2 細(xì)胞、菌種和雞胚26
• 2.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物26
• 2.1.4 主要試劑26-27
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備27
• 2.1.6 主要溶液試劑的配置27-28
• 2.2 試驗(yàn)方法28-46
• 2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建28-32
• 2.2.1.1 引物的設(shè)計(jì)和合成28
• 2.2.1.2 病毒RNA的提取和cDNA合成28-29
• 2.2.1.3 病毒HA和NA基因的擴(kuò)增29
• 2.2.1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、鑒定和純化29-30
• 2.2.1.5 載體和HA、NA基因片段的酶切30-31
• 2.2.1.6 載體和HA、NA基因片段的連接31
• 2.2.1.7 目的基因和載體的轉(zhuǎn)化31
• 2.2.1.8 重組質(zhì)粒SH1/PR8的鑒定31-32
• 2.2.2 重組H1N1亞型豬流感病毒SH1/PR8的拯救32-34
• 2.2.2.1 重組質(zhì)粒的提取32-33
• 2.2.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染33
• 2.2.2.3 重組病毒SH1/PR8的鑒定33-34
• 2.2.3 重組病毒SH1/PR8和原始病毒SH1在MDCK細(xì)胞上生長曲線的測(cè)定34-35
• 2.2.3.1 SH1/PR8和SH1的TCID50檢測(cè)34-35
• 2.2.3.2 SH1/PR8和SH1的HA效價(jià)檢測(cè)35
• 2.2.4 SH1/PR8和SH1在MDCK細(xì)胞上蝕斑的檢測(cè)35-36
• 2.2.5 重組H1N1亞型SIV單價(jià)滅活疫苗的制備36
• 2.2.6 動(dòng)物試驗(yàn)36-43
• 2.2.6.1 小鼠試驗(yàn)36-37
• 2.2.6.2 HI抗體效價(jià)檢測(cè)37-38
• 2.2.6.3 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)38
• 2.2.6.4 血清中特異性IgG抗體效價(jià)檢測(cè)38-39
• 2.2.6.5 攻毒后第 3、5 天肺臟組織病毒含量檢測(cè)及病理學(xué)觀察39-40
• 2.2.6.6 攻毒后14天小鼠體重和存活率的變化40
• 2.2.6.7 豬試驗(yàn)40-41
• 2.2.6.8 血清中抗體的檢測(cè)41-42
• 2.2.6.9 攻毒后第5天鼻拭子、鼻甲骨和肺泡灌洗液病毒含量檢測(cè)42
• 2.2.6.10 攻毒后第5天豬肺臟組織病理學(xué)觀察42-43
• 2.2.7 重組H1N1亞型SIV二價(jià)滅活疫苗的制備及免疫保護(hù)評(píng)價(jià)43-46
• 2.2.7.1 重組病毒G11/PR8和原始病毒G11生長曲線的測(cè)定43
• 2.2.7.2 G11/PR8和G11的TCID50檢測(cè)43
• 2.2.7.3 G11/PR8和G11的HA效價(jià)檢測(cè)43
• 2.2.7.4 重組H1N1亞型SIV二價(jià)滅活疫苗的制備43
• 2.2.7.5 小鼠試驗(yàn)43-44
• 2.2.7.6 HI抗體效價(jià)檢測(cè)44-45
• 2.2.7.7 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)45
• 2.2.7.8 血清中特異性IgG抗體效價(jià)檢測(cè)45
• 2.2.7.9 攻毒后第 3、5 天肺臟組織病毒含量檢測(cè)及病理學(xué)觀察45
• 2.2.7.10 攻毒后14天小鼠體重和存活率的變化45-46
• 3 結(jié)果與分析46-68
• 3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建46-47
• 3.1.1 原始病毒SH1的HA和NA基因擴(kuò)增46
• 3.1.2 重組質(zhì)粒PBD-HA和PBD-NA菌液PCR鑒定46-47
• 3.1.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定47
• 3.2 重組H1N1亞型豬流感病毒SH1/PR8的拯救47
• 3.3 拯救的重組H1N1亞型豬流感病毒SH1/PR8的鑒定47-48
• 3.4 SH1/PR8和在MDCK細(xì)胞上的生長曲線48-49
• 3.4.1 SH1/PR8和SH1的TCID50檢測(cè)48
• 3.4.2 SH1/PR8和SH1的HA效價(jià)檢測(cè)48-49
• 3.5 SH1/PR8和SH1在MDCK細(xì)胞上蝕斑的大小49-50
• 3.6 重組H1N1亞型SIV單價(jià)滅活疫苗的保護(hù)效力評(píng)價(jià)50-59
• 3.6.1 小鼠試驗(yàn)結(jié)果50
• 3.6.2 HI抗體效價(jià)50-51
• 3.6.3 血清中和抗體效價(jià)51
• 3.6.4 血清中特異性IgG抗體效價(jià)51-52
• 3.6.5 攻毒后第 3、5 天小鼠肺臟組織病毒含量52-53
• 3.6.6 攻毒后第5天肺臟組織病理學(xué)的變化53-54
• 3.6.7 攻毒后14天小鼠體重的變化54
• 3.6.8 攻毒后14天小鼠存活率的變化54-55
• 3.6.9 豬試驗(yàn)結(jié)果55
• 3.6.10 豬血清中的抗體的效價(jià)55-57
• 3.6.11 攻毒后第5天豬鼻試子、鼻甲骨和肺泡灌洗液病毒的含量57-58
• 3.6.12 攻毒后第5天豬肺臟病變觀察58-59
• 3.7 重組H1N1亞型SIV二價(jià)滅活疫苗的制備及保護(hù)效力評(píng)價(jià)59-68
• 3.7.1 重組病毒G11/PR8和原始病毒G11在MDCK細(xì)胞上的生長曲線59-60
• 3.7.2 小鼠試驗(yàn)結(jié)果60
• 3.7.3 HI抗體效價(jià)60-61
• 3.7.4 血清中和抗體效價(jià)61-62
• 3.7.5 血清中特異性IgG抗體效價(jià)62-63
• 3.7.6 攻毒后第 3、5 天肺臟組織病毒的含量63-64
• 3.7.7 攻毒后第5天肺臟組織病理學(xué)變化64-66
• 3.7.8 毒后14天小鼠體重的變化66-67
• 3.7.9 攻毒后14天小鼠存活率的變化67-68
• 4 討論68-70
• 5 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-80
• 致謝80-81
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文81

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