本文關(guān)鍵詞：脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗的制備及其免疫效果研究

  更多相關(guān)文章： 鴨坦布蘇病毒 E蛋白 脂質(zhì)體疫苗 抗體 排毒情況 病毒血癥

【摘要】：2010年3月,我國東南地區(qū)出現(xiàn)以種鴨、產(chǎn)蛋鴨嚴(yán)重產(chǎn)蛋下降為主要特征的急性傳染病。隨后,該病迅速蔓延至山東、安徽、福建、河南、河北等地,給我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2010年10月,經(jīng)過我國多個水禽崗位體系專家團(tuán)隊的共同努力,最終確定導(dǎo)致該病的病原為鴨坦布蘇病毒。鴨群在感染鴨坦布蘇病毒后主要臨床癥狀為:精神沉郁,食欲下降,神經(jīng)癥狀明顯,死亡率達(dá)10-30%。主要剖解變化為:卵巢、腦膜、胰腺、氣管、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、等多個器官組織出血,尤其是卵泡出血、變性和破裂明顯。免疫預(yù)防是控制坦布蘇病毒感染的重要措施。由于TMUV分離株之間沒有明顯的變異,亦僅有一種血清型,因此,研制出有效、安全的疫苗進(jìn)行該病的預(yù)防勢在必行。本研究旨在通過制備脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗,并對其免疫效果進(jìn)行研究,為我國的水禽養(yǎng)殖業(yè)提供一種切實有效的預(yù)防鴨坦布蘇病毒的疫苗。首先,通過體外構(gòu)建pet28a-E重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)菌株,使用終濃度為1m M的IPTG于37°C誘導(dǎo)表達(dá)5h得到重組E蛋白,并使用鎳柱對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化,通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白印跡(Western-blot)方法對表達(dá)的蛋白進(jìn)行驗證。E蛋白濃縮后濃度為2.2mg·m L-1。隨后,使用逆相蒸發(fā)法將純化的蛋白制備成脂質(zhì)體疫苗,并使用魚精蛋白法測定疫苗的包封率,以及對疫苗的生物安全性進(jìn)行評價等。在制備脂質(zhì)體疫苗時,卵磷脂與膽固醇的摩爾比為1:1,加入一定量的維生素E可抗脂質(zhì)氧化,之后對制備的疫苗進(jìn)行安全性評價。脂質(zhì)體疫苗包封率檢測結(jié)果為52%,內(nèi)毒素檢測結(jié)果為2.3EU·mg-1,脂質(zhì)過氧化性檢測結(jié)果為0.12,以上指標(biāo)均符合《中華藥典》對疫苗的要求。最后,通過動物試驗對疫苗的免疫效果進(jìn)行評價,選用弗氏佐劑與脂質(zhì)體佐劑進(jìn)行比較。選用84只1日齡櫻桃谷雛鴨進(jìn)行免疫,分為7組:0組(對照組)、1組(脂質(zhì)體1日齡免疫一次)、2組(脂質(zhì)體1、7日齡免疫兩次)、3組(脂質(zhì)體7日齡免疫1次)、4組(弗氏佐劑1日齡免疫一次)、5組(弗氏佐劑1、7日齡免疫兩次)、6組(弗氏佐劑7日齡免疫1次)。每7d采集一次血液檢測血清中抗體水平,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)方法進(jìn)行抗體檢測,結(jié)果顯示:2組(脂質(zhì)體1、7日齡免疫兩次)比其他組產(chǎn)生的抗體量更高,且抗體持續(xù)時間更久,抗體在第四周達(dá)到最高值,一直到實驗結(jié)束后依然保持在陽性值以上。在疫苗免疫三周后對櫻桃谷鴨進(jìn)行攻毒實驗,接種劑量為每只鴨1m L 102.4 TCID50,接毒后,每組隨機(jī)挑選6只每天無菌采集一次血漿,用于病毒血癥的檢測,無菌采集雛鴨泄殖腔棉拭子及口咽棉拭子,檢測病毒排放情況。病毒血癥及病毒排毒量檢測情況看,脂質(zhì)體疫苗免疫兩次組無病毒陽性檢出,其他組均有不同程度的病毒陽性檢出。通過抗體水平及病毒排放情況看,脂質(zhì)體疫苗免疫兩次組的免疫保護(hù)效果優(yōu)于其他組。本研究為脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗應(yīng)用于臨床預(yù)防鴨坦布蘇病毒病提供了切實有力的實驗依據(jù),對我國將來實現(xiàn)鴨坦布蘇病毒的凈化具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：鴨坦布蘇病毒 E蛋白 脂質(zhì)體疫苗 抗體 排毒情況 病毒血癥
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-23
• 1.1 鴨坦布蘇病毒的一般生物學(xué)特性11-14
• 1.1.1 分類11-12
• 1.1.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)12
• 1.1.3 基因組及編碼蛋白12-13
• 1.1.4 理化特性和培養(yǎng)特性13-14
• 1.2 鴨坦布蘇病毒病的流行病學(xué)研究14
• 1.3 鴨坦布蘇病毒病的臨床癥狀及病理變化14-15
• 1.3.1 臨床癥狀14-15
• 1.3.2 病理變化15
• 1.4 鴨坦布蘇病毒診斷方法研究進(jìn)展15-17
• 1.4.1 臨床診斷15
• 1.4.2 實驗室診斷15-17
• 1.5 鴨坦布蘇病毒感染的防制17-18
• 1.5.1 生物安全措施17-18
• 1.5.2 疫苗研究進(jìn)展18
• 1.6 脂質(zhì)體概述18-22
• 1.6.1 脂質(zhì)體作為佐劑的優(yōu)勢19
• 1.6.2 脂質(zhì)體疫苗的制備19-21
• 1.6.3 影響免疫效果的相關(guān)因素21
• 1.6.4 脂質(zhì)體疫苗的安全性檢測21-22
• 1.7 本研究的目的及意義22-23
• 1.8 創(chuàng)新點23
• 2 材料與方法23-35
• 2.1 試驗材料23-26
• 2.1.1 主要試驗材料23-24
• 2.1.2 主要試驗儀器24
• 2.1.3 主要試驗動物24
• 2.1.4 試驗相關(guān)溶液的配制24-26
• 2.2 試驗方法26-35
• 2.2.1 鴨坦布蘇病毒E基因的克隆26-28
• 2.2.2 pet28a-E 重組表達(dá)載體的構(gòu)建28-31
• 2.2.3 鴨坦布蘇病毒E蛋白的制備31-33
• 2.2.4 脂質(zhì)體包被鴨坦布蘇病毒E蛋白疫苗的制備33-34
• 2.2.5 脂質(zhì)體疫苗免疫效果研究34-35
• 3 結(jié)果與分析35-41
• 3.1 鴨坦布蘇病毒E基因的擴(kuò)增35
• 3.2 E蛋白的純化與驗證35-36
• 3.3 蛋白濃度測定結(jié)果36
• 3.4 脂質(zhì)體包被E蛋白疫苗的制備36-37
• 3.4.1 脂質(zhì)體包封率的檢測結(jié)果36
• 3.4.2 疫苗內(nèi)毒素檢測檢驗結(jié)果36-37
• 3.4.3 疫苗脂質(zhì)過氧化性檢測結(jié)果37
• 3.4.4 疫苗質(zhì)量檢驗結(jié)果37
• 3.5 脂質(zhì)體疫苗免疫效果37-41
• 3.5.1 血清中坦布蘇病毒特異性抗體檢測結(jié)果37-38
• 3.5.2 病毒血癥及排毒檢測結(jié)果38-41
• 4 討論41-45
• 4.1 鴨坦布蘇病毒病的流行狀況41
• 4.2 脂質(zhì)體相關(guān)疫苗研究成果41
• 4.3 脂質(zhì)體E蛋白疫苗的質(zhì)量檢驗41-42
• 4.4 脂質(zhì)體疫苗免疫效果42-45
• 5 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-60
• 致謝60-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1070235