本文關(guān)鍵詞：miR-142-3p通過調(diào)控靶基因PTPN11影響乳腺上皮細胞MCF-10A的增殖

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【摘要】：mi RNA是一類非編碼的長度在21-24nt RNA,在翻譯水平上調(diào)節(jié)基因的表達,其作用遍及整個生命過程,有研究顯示,預(yù)計大于1/3的人類基因都是mi RNA的靶基因。mi RNA在對細胞的代謝與增殖、凋亡、以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生理和病理過程得到了廣泛的研究。mi RNA正確表達是乳腺發(fā)育與泌乳的重要保證,已有研究表明mi R-142-3p在乳腺中有抑制增殖作用,但其如何通過靶位點調(diào)控乳腺增殖等機制尚不清楚。本研究以乳腺上皮細胞MCF-10A為實驗?zāi)Ｐ?結(jié)合本教研室RAN免疫共沉淀實驗結(jié)果,應(yīng)用mi R-142-3p超表達子和抑制子,研究mi R-142-3p在乳腺上皮細胞中對調(diào)控靶點PTPN11的作用及對乳腺上皮細胞的增殖的影響。應(yīng)用活細胞RNA納米檢測技術(shù)、熒光定量PCR、Wester n blotting技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、驗證了mi R-142-3p對基因PTPN11的調(diào)控作用。應(yīng)用Wester n blotting技術(shù)檢測mi R-142-3p對PTP N11介導(dǎo)的增殖相關(guān)通路基因蛋白表達的影響,采用EDU熒光標記技術(shù)探究mi R-142-3p對細胞的增殖的影響,初步探究mi R-142-3p在乳腺上皮細胞中對增殖作用的機制。結(jié)果:(1)在乳腺上皮細胞中過表達/沉默基因mi R-142-3p后,應(yīng)用活細胞RNA納米檢測技術(shù)檢測mi R-142-3p表達,q RT-PCR檢測PTPN11m RNA基因的表達量,同時應(yīng)用Western blotting技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測PTPN11編碼的S HP2蛋白表達變化,結(jié)果表明:mi R-142-3p負向調(diào)控PTPN11m RNA及SHP2蛋白的表達,分別從基因表達水平,蛋白表達水平證明了mi R-142-3p調(diào)控PTPN11的表達。(2)采用PTPN11 si RNA干擾技術(shù),將干擾片段轉(zhuǎn)染MCF-10A細胞,繼而應(yīng)用q RT-PCR技術(shù)檢測PTPN11m RNA的表達變化,Western blotting技術(shù)檢測PTPN11蛋白表達量的變化,結(jié)果表明mi R-142-3p超表達后對PTPN11表達的改變同PTPN11基因干擾后的結(jié)果趨勢一致。(3)MCF-10A細胞中過表達mi R-142-3p后,應(yīng)用Western blotting技術(shù)檢測PI3K-AKT、RAS-ERK-MEK通路蛋白變化,發(fā)現(xiàn)PI 3K、AKT、Raf-B、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表達量下調(diào),過表達組mi R-142-3p表達量顯著低于對照組(P0.05),在MCF-10A細胞中沉默mi R-142-3p得到相反的實驗結(jié)果。應(yīng)用EDU檢測試劑盒檢測mi R-142-3p對乳腺上皮細胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)mi R-142-3p抑制乳腺上皮細胞MCF-10A的增殖。結(jié)論:mi R-142-3p在乳腺上皮細胞中通過調(diào)控靶基因PTPN11調(diào)控PI3K/AKT、RAS-ERK-MEK的變化繼而抑制乳腺上皮細胞的增殖能力。
【關(guān)鍵詞】：乳腺上皮細胞MCF-10A mi R-142-3p 靶基因 增殖
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 miRNAs的研究進展11-13
• 1.1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及命名11
• 1.1.2 miRNA的生物合成過程11-12
• 1.1.3 miRNA的生物學(xué)特征及功能12
• 1.1.4 miRNA的檢測技術(shù)12-13
• 1.2 miRNA的靶基因的尋找及驗證13-15
• 1.2.1 miRNA的靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測13-14
• 1.2.2 靶基因的驗證14-15
• 1.3 miR142 3p研究進展15
• 1.4 基因PTPN11的研究進展15-17
• 1.5 miRNA對腫瘤的調(diào)控17-18
• 1.6 研究的目的及意義18-19
• 2 材料與方法19-30
• 2.1 實驗材料19
• 2.2 實驗儀器19-20
• 2.3 實驗試劑20
• 2.4 試劑配制20-21
• 2.5 實驗方法與步驟21-30
• 2.5.1 miR1423p靶基因的篩選21-22
• 2.5.2 乳腺上皮細胞的培養(yǎng)22
• 2.5.3 過表達miR1423p對乳腺上皮細胞MCF-10A的影響22-27
• 2.5.4 抑制miR1423p對乳腺上皮細胞的作用27-28
• 2.5.5 過表達miR1423p在PTP N11沉寂后對乳腺上皮細胞MCF-10A的影響28-29
• 2.5.6 數(shù)據(jù)處理29-30
• 3 結(jié)果30-43
• 3.1 靶基因的篩選30-32
• 3.1.1 RNA- 蛋白免疫共沉淀結(jié)果分析30-32
• 3.1.2 miR1423p與PTP N11的作用位點32
• 3.2 miR142 3p基因過表達對乳腺上皮細胞MCF-10A的影響32-36
• 3.2.1 活細胞RNA納米檢測技術(shù)檢測miR1423p表達32-33
• 3.2.2 miR1423p mimics對乳腺上皮細胞PTP N11基因表達的影響33-34
• 3.2.3 miR1423p mimics對乳腺上皮細胞PTP N11基因及增殖的相關(guān)通路蛋白的影響34-35
• 3.2.4 免疫組化35
• 3.2.5 miR1423p mim ics對乳腺上皮細胞增殖能力的影響35-36
• 3.3 miR142 3p基因沉寂對乳腺上皮細胞MCF-10A的影響36-40
• 3.3.1 活細胞RNA納米檢測技術(shù)檢測miR1423p沉寂后miR1423p表達36-37
• 3.3.2 miR1423p inhibitor對乳腺上皮細胞PTP N11基因表達的影響37-38
• 3.3.3 miR-142-3pinhibitor對乳腺上皮細胞PTPN11基因及增殖的相關(guān)通路蛋白的影響38-39
• 3.3.4 免疫組化39
• 3.3.5 miR-142-3pinhibitor對乳腺上皮細胞增殖能力的影響39-40
• 3.4 PTPN11沉寂后對乳腺上皮細胞的影響40-43
• 3.4.1 PTPN11干擾片段的選擇40-41
• 3.4.2 熒光定量P CR檢測PTP N11 mRNA表達41-42
• 3.4.3 檢驗PTPN11基因抑制后蛋白的表達變化42-43
• 4 討論43-46
• 4.1 miR142 3p檢測及靶基因篩選及驗證43-44
• 4.1.1 miR1423p靶基因的篩選43
• 4.1.2 miR1423p基因的檢測43-44
• 4.2 miR142 3p對乳腺上皮細胞增殖及相關(guān)信號通路蛋白的影響44-46
• 5 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻48-54
• 附錄54-55
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文55

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本文編號：1067481