發(fā)布時間：2017-10-20 13:00

  本文關(guān)鍵詞：鵪鶉Leptin及其受體基因的克隆及功能研究

  更多相關(guān)文章： 鵪鶉 Leptin LEPR 基因克隆 可變剪接 生物學(xué)調(diào)控

【摘要】：自1998年“雞Leptin基因”被首次報道以來,雞Leptin基因序列的正確性,甚至Leptin是否在家禽中存在就一直備受爭議。雖然家禽中Leptin受體(LEPR)的存在被廣泛證實,但對其功能的研究卻由于內(nèi)源性Leptin的缺乏而受到限制。直到2014年,野生鳥類Leptin基因的成功克隆,部分回答了禽類中是否存在Leptin基因這一長久困擾禽類Leptin/LEPR研究的問題,克服了禽類Leptin/LEPR研究的瓶頸。自此,Leptin/LEPR在禽類尤其是家禽中的克隆和功能研究成為目前研究的熱點。本研究在公開數(shù)據(jù)庫序列搜索和分析的基礎(chǔ)上,首先對鵪鶉Leptin及其受體LEPR基因進行克隆和結(jié)構(gòu)分析,并采用實時熒光定量PCR的方法對其組織表達(dá)模式進行研究;以3周齡(未開產(chǎn))和20周齡(高產(chǎn)期)的朝鮮龍城黃羽母鵪鶉為研究對象,對其性腺軸上的繁殖相關(guān)基因及Leptin/LEPR在兩個發(fā)育階段的表達(dá)差異進行檢測,探究Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系;以3周齡朝鮮龍城母鵪鶉為研究對象,對其進行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理,分析不同處理條件下促食欲基因、抑食基因以及Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況,探究Leptin/LEPR與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系。主要得到以下結(jié)果:1.運用已公布的禽類Leptin序列在日本鵪鶉的SRA數(shù)據(jù)庫中進行同源序列查找,根據(jù)拼接獲得的鵪鶉Leptin序列設(shè)計PCR引物,首次克隆了鵪鶉Leptin基因外顯子4(參照野生鳥類的基因結(jié)構(gòu))的部分核苷酸序列;序列分析表明其GC含量較高(64%),其預(yù)測氨基酸序列與其他脊椎動物L(fēng)eptin的氨基酸序列一致性較低,但擁有保守的結(jié)構(gòu)域。2.運用兼并引物設(shè)計和PCR克隆技術(shù),首次克隆得到了鵪鶉LEPR的CDS序列,同時鑒定出該受體的四種不同的剪接亞型,其中qLEPRl屬于長型受體,其預(yù)測氨基酸序列包含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的所有保守的基序、結(jié)構(gòu)域和基本的殘基,而其他三種亞型(qLEPR-a、qLEPR-b和qLEPR-c)屬于可溶型受體,缺乏跨膜域和胞內(nèi)域,同時也缺乏Leptin的綁定結(jié)合域;基因進化分析表明,鵪鶉LEPR與Leptin在脊椎動物中的進化關(guān)系相似,其與家禽尤其是雞形目的物種同源性最高。3.運用實時熒光定量PCR技術(shù)對已獲得的Leptin/LEPR進行組織表達(dá)模式的研究,結(jié)果表明,鵪鶉Leptin和LEPR呈廣泛性組織表達(dá)特點,提示其具有廣泛的生物學(xué)功能。鵪鶉Leptin在骨骼肌、胰腺和下丘腦中表達(dá)相對較高,而LEPR在垂體中極高表達(dá),提示Leptin/LEPR在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色。鵪鶉Leptin/LEPR在肝臟和脂肪組織中低表達(dá),表明鵪鶉Leptin不是一個脂肪依賴性分泌的激素。4.通過對繁殖相關(guān)基因和Leptin/LEPR在鵪鶉不同發(fā)育階段差異表達(dá)的研究,初步探究了Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系,結(jié)果顯示,與3周齡鵪鶉相比,20周齡鵪鶉繁殖相關(guān)基因(GnRH-I、FSH-β、FSHR和LHR)在性腺軸上顯著上調(diào)表達(dá),其性腺軸被激活,此時,Leptin和t-qLEPR(包含鵪鶉LEPR的所有亞型)在其下丘腦和垂體中也上調(diào)表達(dá),表明Leptin/LEPR與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系;伴隨著鵪鶉的性成熟并進入產(chǎn)蛋高峰期,促卵泡發(fā)育和卵巢激素分泌的基因(如:LHR和FSHR)上調(diào)表達(dá),然而Leptin和t-qLEPR在20周齡鵪鶉的卵巢中表達(dá)下調(diào),同時凋亡基因caspase3在其卵泡中的表達(dá)也下調(diào),表明Leptin/LEPR系統(tǒng)對鵪鶉卵泡的發(fā)育有一定的抑制效應(yīng)。5.本試驗通過對3周齡鵪鶉進行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理,并檢測其促食欲基因(AgRP/NPY)、厭食基因(POMC和MC4R)和Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況,初步探究了Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系,結(jié)果顯示,AgRP/NPY在禁食階段顯著上調(diào),在恢復(fù)采食時顯著下調(diào);POMC和MC4R在禁食和恢復(fù)采食階段不同程度的下調(diào);而Leptin/LEPR的表達(dá)在禁食時上調(diào),恢復(fù)采食時下調(diào);這些結(jié)果表明Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)控。綜上所述,鵪鶉Leptin及其受體LEPR被首次克隆獲得,擁有不同于其他動物同源物的獨特的組織表達(dá)模式;鵪鶉Leptin不是一個脂肪或肝臟依賴性分泌的激素,其在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色;Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系,同時對鵪鶉卵泡的發(fā)育有一定的抑制效應(yīng);Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：鵪鶉 Leptin LEPR 基因克隆 可變剪接 生物學(xué)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S839
【目錄】：

• 致謝4-11
• 摘要11-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1.1 Leptin及其受體的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)13-15
• 1.1.1 Leptin的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.2 LEPR的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2 Leptin及其受體的分子調(diào)控機制15-18
• 1.2.1 Leptin/LEPR介導(dǎo)JAK-STAT信號通路16-17
• 1.2.2 Leptin/LEPR介導(dǎo)AMPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑17-18
• 1.3 禽類Leptin及LEPR的研究進展18-22
• 1.3.1 禽類Leptin/LEPR基因的分子克隆18-19
• 1.3.1.1 禽類Leptin基因的分子克隆18-19
• 1.3.1.2 禽類LEPR基因的分子克隆19
• 1.3.2 禽類Leptin/LEPR的組織表達(dá)模式19
• 1.3.3 禽類“Leptin/LEPR的生理功能”19-22
• 1.3.3.1 采食與能量調(diào)控20
• 1.3.3.2 生長發(fā)育20-21
• 1.3.3.3 繁殖調(diào)控21
• 1.3.3.4 小結(jié)21-22
• 2 引言22-23
• 3 鵪鶉Leptin及LEPR基因的分子克隆及生物信息學(xué)分析23-39
• 3.1 試驗材料23-24
• 3.1.1 試驗動物23
• 3.1.2 試驗主要試劑及配制23
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備23-24
• 3.2 試驗方法24-28
• 3.2.1 基因組DNA的提取及檢測24-25
• 3.2.1.1 基因組DNA的提取24-25
• 3.2.1.2 基因組DNA質(zhì)量檢測25
• 3.2.2 組織總RNA的提取檢測及cDNA的合成25-26
• 3.2.2.1 組織總RNA的提取25
• 3.2.2.2 組織總RNA質(zhì)量檢測25-26
• 3.2.2.3 cDNA的合成26
• 3.2.3 鵪鶉Leptin及LEPR基因的克隆及測序26-28
• 3.2.3.1 引物設(shè)計與合成26-27
• 3.2.3.2 PCR反應(yīng)條件27-28
• 3.2.3.3 PCR產(chǎn)物檢測純化與測序28
• 3.2.4 生物信息學(xué)和進化分析28
• 3.3 結(jié)果與分析28-37
• 3.3.1 基因組DNA與組織RNA質(zhì)量檢測28-29
• 3.3.1.1 基因組DNA質(zhì)量檢測28
• 3.3.1.2 組織RNA質(zhì)量檢測28-29
• 3.3.2 鵪鶉Leptin基因的克隆及結(jié)構(gòu)特點29-30
• 3.3.3 鵪鶉LEPR基因不同剪接亞型的克隆與鑒定30-35
• 3.3.4 Leptin及LEPR基因的分子進化分析35-37
• 3.4 討論37-38
• 3.5 小結(jié)38-39
• 4 鵪鶉Leptin/LEPR組織表達(dá)模式研究39-45
• 4.1 試驗材料39
• 4.1.1 試驗樣品39
• 4.1.2 試驗主要試劑及配制39
• 4.1.3 主要儀器39
• 4.2 試驗方法39-41
• 4.2.1 組織總RNA的提取39
• 4.2.2 組織總RNA質(zhì)量檢測39
• 4.2.3 cDNA的合成39
• 4.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）特異性引物設(shè)計39-40
• 4.2.5 qRT-PCR引物特異性檢測40
• 4.2.6 qRT-PCR反應(yīng)40
• 4.2.7 目的基因的計算方法選擇40-41
• 4.2.8 數(shù)據(jù)分析41
• 4.3 結(jié)果與分析41-43
• 4.3.1 組織RNA質(zhì)量檢測41
• 4.3.2 引物特異性檢測41
• 4.3.3 鵪鶉Leptin/LEPR的組織表達(dá)41-43
• 4.4 討論43-44
• 4.4.1 鵪鶉Leptin/LEPR的組織表達(dá)模式43
• 4.4.2 Leptin/LEPR在鵪鶉垂體和下丘腦中的表達(dá)43-44
• 4.4.3 Leptin/LEPR在鵪鶉脂肪和肝臟組織中的表達(dá)44
• 4.5 小結(jié)44-45
• 5 Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系45-51
• 5.1 試驗材料45
• 5.1.1 試驗樣品45
• 5.1.2 試驗主要試劑及配制45
• 5.1.3 主要儀器45
• 5.2 試驗方法45-46
• 5.2.1 組織總RNA的提取45
• 5.2.2 組織總RNA質(zhì)量檢測45
• 5.2.3 cDNA的合成45
• 5.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物設(shè)計45-46
• 5.2.5 qRT-PCR引物特異性檢測46
• 5.2.6 qRT-PCR反應(yīng)46
• 5.2.7 數(shù)據(jù)分析46
• 5.3 結(jié)果與分析46-49
• 5.3.1 組織RNA質(zhì)量檢測46-47
• 5.3.2 引物特異性檢測47
• 5.3.3 鵪鶉性腺軸上繁殖相關(guān)基因的驗證47-48
• 5.3.4 Leptin/LEPR在鵪鶉不同發(fā)育階段的差異表達(dá)48-49
• 5.4 討論49-50
• 5.4.1 鵪鶉Leptin/LEPR系統(tǒng)與繁殖軸的激活作用49
• 5.4.2 鵪鶉Leptin/LEPR系統(tǒng)與卵泡發(fā)育的關(guān)系49
• 5.4.3 Leptin/LEPR系統(tǒng)在鵪鶉高產(chǎn)期脂質(zhì)代謝中的作用49-50
• 5.5 小結(jié)50-51
• 6 Leptin/LEPR與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系51-58
• 6.1 試驗材料51
• 6.1.1 試驗動物51
• 6.1.2 試驗主要試劑及配制51
• 6.1.3 主要儀器51
• 6.2 試驗方法51-53
• 6.2.1 組織總RNA的提取51-52
• 6.2.2 組織總RNA質(zhì)量檢測52
• 6.2.3 cDNA的合成52
• 6.2.4 qRT-PCR引物設(shè)計52
• 6.2.5 qRT-PCR引物特異性檢測52
• 6.2.6 qRT-PCR反應(yīng)52
• 6.2.7 數(shù)據(jù)分析52-53
• 6.3 結(jié)果與分析53-55
• 6.3.1 組織總RNA質(zhì)量檢測53
• 6.3.2 引物特異性檢測53
• 6.3.3 禁食和禁食后恢復(fù)采食對食欲因子表達(dá)影響53-54
• 6.3.4 禁食和禁食后恢復(fù)采食對鵪鶉Leptin/LEPR表達(dá)的影響54-55
• 6.4 討論55-56
• 6.5 小結(jié)56-58
• 7 全文總結(jié)58-60
• 參考文獻(xiàn)60-69
• ABSTRACT69-71

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