發(fā)布時間：2017-10-20 10:02

  本文關(guān)鍵詞：山東省貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定及三價滅活菌對小鼠的免疫效力評價

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【摘要】：水貂出血性肺炎是一種由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)引起的以肺部瘀血、敗血癥為主要特征的水貂急性呼吸道傳染病。該病以地方性流行為主,發(fā)病迅速,病死率高,常造成水貂養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失。由于該病病原菌存在廣泛,耐藥菌株較多,致使貂感染發(fā)病后藥物治療效果不佳。目前認為,防治該病的主要措施是應(yīng)用與致病菌血清型相匹配的滅活菌進行免疫接種。因此,水貂出血性肺炎流行地區(qū)的致病菌分離鑒定,血清型調(diào)查是制備多價滅活疫苗的前提和基礎(chǔ)。本研究開展了山東省水貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定、病原菌血清型分布調(diào)查和三價滅活菌對小鼠的免疫效力檢測等方面的研究。病原菌分離鑒定。2013年至2014年,從山東省諸城、濰坊、臨沂、文登、日照、莒縣、膠南等地區(qū)的18個養(yǎng)貂場共采集77份病貂肺臟樣本,分離得到120株疑似銅綠假單胞菌。經(jīng)生化試驗、16S r DNA的PCR擴增和血清型鑒定,最終確定其中53株分離菌為銅綠假單胞菌,分離率為44.2%(53/120)。53株銅綠假單胞菌包含11個已知血清型和一株未確定型。其中G型菌株最多,有27株;其次為B型、D型,分別為5株和4株。分離菌株中主要流行血清型為G型、B型和D型。免疫原的篩選。將分屬于11個血清型的15株銅綠假單胞菌分別用甲醛滅活,與佐劑混合后對新西蘭白兔連續(xù)免疫三次,采集免疫血清。用免疫血清分別與15株菌做交叉凝集試驗,結(jié)果顯示,G型、B型、D型、N型血清與多種血清型的菌株發(fā)生凝集。依據(jù)血清型鑒定結(jié)果和血清學交叉保護結(jié)果確定可以作為水貂出血性肺炎滅活疫苗的血清型為G、B、D型。通過血清交叉凝集試驗、對小鼠半數(shù)致死量測定和生長曲線測定,確定了候選疫苗株為SD004、SD050、SD052。三價滅活菌免疫效力檢測。測定候選株SD004、SD050、SD052傳代穩(wěn)定性,結(jié)果顯示候選株SD004、SD050、SD052在20代內(nèi)連續(xù)傳代菌體含量雖有所變化,但都在同一數(shù)量級內(nèi)浮動;20代內(nèi)3株疫苗候選株致病性也在同一數(shù)量級內(nèi)波動,3株候選株20代內(nèi)的生長性能、致病性均穩(wěn)定;對三株疫苗株進行包括培養(yǎng)基的選擇,培養(yǎng)溫度、時間、培養(yǎng)基p H等培養(yǎng)條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)37℃條件下p H7.0~7.5的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)22~24h對候選株菌液生產(chǎn)應(yīng)用最適宜;分別用相同菌體含量不同免疫劑量的三價滅活菌免疫昆明鼠,21 d后用10 LD5 0的候選株菌液攻毒,確定疫苗對小鼠的最小免疫劑量為0.15m L,即接種1.125×1011CFU三價滅活菌可以保證小鼠受到100%保護;小鼠肺臟病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量的增強可以有效保護小鼠,預防銅綠假單胞菌的感染;血清抗體水平檢測表明水貂出血性肺炎三價滅活菌免疫小鼠后在28 d血清抗體達到峰值,42 d開始下降,49 d仍能檢測到抗體存在;同時發(fā)現(xiàn)對小鼠兩次免疫血清抗體滴度比一次免疫的抗體滴度要高,保護效果更好;將三價滅活菌0.15m L/只免疫昆明鼠,21 d后攻毒,小鼠無一死亡,證明其受到100%免疫保護。同時剖取免疫組小鼠的肺、腎、肝等內(nèi)臟,發(fā)現(xiàn)免疫過三價滅活菌的小鼠攻毒后小鼠內(nèi)臟無明顯病理學變化,進一步證明三價滅活菌可以對小鼠提供有效保護。本研究證明,通過血清學調(diào)查并對優(yōu)勢流行菌株進行生物學特性的檢測,獲得分離菌株具有良好的免疫原性,誘導小鼠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答,可以作為預防水貂出血性肺炎流行的候選疫苗菌株。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 血清型 水貂出血性肺炎 疫苗
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-21
• 1.1 銅綠假單胞菌概述12-16
• 1.1.1 分類及其理化特性12
• 1.1.2 銅綠假單胞菌分型12-14
• 1.1.3 致病性及毒力因子14-15
• 1.1.4 耐藥性15-16
• 1.2 水貂出血性肺炎及其防治16-20
• 1.2.1 病原16
• 1.2.2 流行病學和臨床癥狀16-17
• 1.2.3 發(fā)病機制和病理變化17
• 1.2.4 診斷17-18
• 1.2.5 防治18-20
• 1.3 研究目的與意義20-21
• 2 材料與方法21-29
• 2.1 實驗材料21-22
• 2.1.1 病料樣本、參考菌株和實驗動物21
• 2.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基21
• 2.1.3 DNA擴增引物21-22
• 2.1.4 主要儀器22
• 2.2 實驗方法22-29
• 2.2.1 病原菌的分離鑒定22-23
• 2.2.2 分離菌部分生物學特性檢測23-24
• 2.2.3 疫苗候選菌株培養(yǎng)及滅活條件優(yōu)化24-25
• 2.2.4 候選菌株傳代穩(wěn)定性檢測25-26
• 2.2.5 滅活菌的制備及免疫效力檢測26-29
• 3 結(jié)果29-49
• 3.1 細菌的分離鑒定29-36
• 3.1.1 分離菌的染色鏡檢和培養(yǎng)特性29-31
• 3.1.2 生化鑒定31-32
• 3.1.3 PCR鑒定32-34
• 3.1.4 血清型鑒定34-36
• 3.2 分離株部分生物學特性檢測36-39
• 3.2.1 標準曲線測定36-37
• 3.2.2 血清交叉凝集試驗37
• 3.2.3 致病性測定37-39
• 3.2.4 生長曲線測定39
• 3.3 疫苗株培養(yǎng)條件及甲醛滅活濃度優(yōu)化39-42
• 3.3.1 培養(yǎng)基的選擇39-40
• 3.3.2 培養(yǎng)溫度確定40
• 3.3.3 培養(yǎng)基p H的確定40-41
• 3.3.4 培養(yǎng)時間確定41-42
• 3.3.5 甲醛滅活濃度確定42
• 3.4 候選菌株傳代穩(wěn)定性檢測42-44
• 3.4.1 傳代菌生長穩(wěn)定性42-43
• 3.4.2 傳代菌致病性43
• 3.4.3 傳代菌對小鼠的免疫保護43-44
• 3.5 三價滅活菌免疫效力檢測44-49
• 3.5.1 三價滅活菌制備及檢驗44
• 3.5.2 最小免疫劑量確定44-46
• 3.5.3 三價滅活菌對小鼠免疫保護46-49
• 4 討論49-52
• 4.1 細菌的分離鑒定49
• 4.2 三價滅活菌候選菌株的選擇49-50
• 4.3 候選菌株致病性和傳代穩(wěn)定性50
• 4.4 三價滅活菌對小鼠免疫效力評估50-52
• 5 結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻54-63
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文63

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本文編號：1066655