本文關(guān)鍵詞：山東省貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定及三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠的免疫效力評(píng)價(jià)

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【摘要】：水貂出血性肺炎是一種由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)引起的以肺部瘀血、敗血癥為主要特征的水貂急性呼吸道傳染病。該病以地方性流行為主,發(fā)病迅速,病死率高,常造成水貂養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病病原菌存在廣泛,耐藥菌株較多,致使貂感染發(fā)病后藥物治療效果不佳。目前認(rèn)為,防治該病的主要措施是應(yīng)用與致病菌血清型相匹配的滅活菌進(jìn)行免疫接種。因此,水貂出血性肺炎流行地區(qū)的致病菌分離鑒定,血清型調(diào)查是制備多價(jià)滅活疫苗的前提和基礎(chǔ)。本研究開(kāi)展了山東省水貂源銅綠假單胞菌的分離鑒定、病原菌血清型分布調(diào)查和三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠的免疫效力檢測(cè)等方面的研究。病原菌分離鑒定。2013年至2014年,從山東省諸城、濰坊、臨沂、文登、日照、莒縣、膠南等地區(qū)的18個(gè)養(yǎng)貂場(chǎng)共采集77份病貂肺臟樣本,分離得到120株疑似銅綠假單胞菌。經(jīng)生化試驗(yàn)、16S r DNA的PCR擴(kuò)增和血清型鑒定,最終確定其中53株分離菌為銅綠假單胞菌,分離率為44.2%(53/120)。53株銅綠假單胞菌包含11個(gè)已知血清型和一株未確定型。其中G型菌株最多,有27株;其次為B型、D型,分別為5株和4株。分離菌株中主要流行血清型為G型、B型和D型。免疫原的篩選。將分屬于11個(gè)血清型的15株銅綠假單胞菌分別用甲醛滅活,與佐劑混合后對(duì)新西蘭白兔連續(xù)免疫三次,采集免疫血清。用免疫血清分別與15株菌做交叉凝集試驗(yàn),結(jié)果顯示,G型、B型、D型、N型血清與多種血清型的菌株發(fā)生凝集。依據(jù)血清型鑒定結(jié)果和血清學(xué)交叉保護(hù)結(jié)果確定可以作為水貂出血性肺炎滅活疫苗的血清型為G、B、D型。通過(guò)血清交叉凝集試驗(yàn)、對(duì)小鼠半數(shù)致死量測(cè)定和生長(zhǎng)曲線測(cè)定,確定了候選疫苗株為SD004、SD050、SD052。三價(jià)滅活菌免疫效力檢測(cè)。測(cè)定候選株SD004、SD050、SD052傳代穩(wěn)定性,結(jié)果顯示候選株SD004、SD050、SD052在20代內(nèi)連續(xù)傳代菌體含量雖有所變化,但都在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)浮動(dòng);20代內(nèi)3株疫苗候選株致病性也在同一數(shù)量級(jí)內(nèi)波動(dòng),3株候選株20代內(nèi)的生長(zhǎng)性能、致病性均穩(wěn)定;對(duì)三株疫苗株進(jìn)行包括培養(yǎng)基的選擇,培養(yǎng)溫度、時(shí)間、培養(yǎng)基p H等培養(yǎng)條件的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)37℃條件下p H7.0~7.5的肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)22~24h對(duì)候選株菌液生產(chǎn)應(yīng)用最適宜;分別用相同菌體含量不同免疫劑量的三價(jià)滅活菌免疫昆明鼠,21 d后用10 LD5 0的候選株菌液攻毒,確定疫苗對(duì)小鼠的最小免疫劑量為0.15m L,即接種1.125×1011CFU三價(jià)滅活菌可以保證小鼠受到100%保護(hù);小鼠肺臟病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量的增強(qiáng)可以有效保護(hù)小鼠,預(yù)防銅綠假單胞菌的感染;血清抗體水平檢測(cè)表明水貂出血性肺炎三價(jià)滅活菌免疫小鼠后在28 d血清抗體達(dá)到峰值,42 d開(kāi)始下降,49 d仍能檢測(cè)到抗體存在;同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠兩次免疫血清抗體滴度比一次免疫的抗體滴度要高,保護(hù)效果更好;將三價(jià)滅活菌0.15m L/只免疫昆明鼠,21 d后攻毒,小鼠無(wú)一死亡,證明其受到100%免疫保護(hù)。同時(shí)剖取免疫組小鼠的肺、腎、肝等內(nèi)臟,發(fā)現(xiàn)免疫過(guò)三價(jià)滅活菌的小鼠攻毒后小鼠內(nèi)臟無(wú)明顯病理學(xué)變化,進(jìn)一步證明三價(jià)滅活菌可以對(duì)小鼠提供有效保護(hù)。本研究證明,通過(guò)血清學(xué)調(diào)查并對(duì)優(yōu)勢(shì)流行菌株進(jìn)行生物學(xué)特性的檢測(cè),獲得分離菌株具有良好的免疫原性,誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答,可以作為預(yù)防水貂出血性肺炎流行的候選疫苗菌株。
【關(guān)鍵詞】：銅綠假單胞菌 血清型 水貂出血性肺炎 疫苗
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 引言12-21
• 1.1 銅綠假單胞菌概述12-16
• 1.1.1 分類(lèi)及其理化特性12
• 1.1.2 銅綠假單胞菌分型12-14
• 1.1.3 致病性及毒力因子14-15
• 1.1.4 耐藥性15-16
• 1.2 水貂出血性肺炎及其防治16-20
• 1.2.1 病原16
• 1.2.2 流行病學(xué)和臨床癥狀16-17
• 1.2.3 發(fā)病機(jī)制和病理變化17
• 1.2.4 診斷17-18
• 1.2.5 防治18-20
• 1.3 研究目的與意義20-21
• 2 材料與方法21-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 2.1.1 病料樣本、參考菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基21
• 2.1.3 DNA擴(kuò)增引物21-22
• 2.1.4 主要儀器22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 2.2.1 病原菌的分離鑒定22-23
• 2.2.2 分離菌部分生物學(xué)特性檢測(cè)23-24
• 2.2.3 疫苗候選菌株培養(yǎng)及滅活條件優(yōu)化24-25
• 2.2.4 候選菌株傳代穩(wěn)定性檢測(cè)25-26
• 2.2.5 滅活菌的制備及免疫效力檢測(cè)26-29
• 3 結(jié)果29-49
• 3.1 細(xì)菌的分離鑒定29-36
• 3.1.1 分離菌的染色鏡檢和培養(yǎng)特性29-31
• 3.1.2 生化鑒定31-32
• 3.1.3 PCR鑒定32-34
• 3.1.4 血清型鑒定34-36
• 3.2 分離株部分生物學(xué)特性檢測(cè)36-39
• 3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定36-37
• 3.2.2 血清交叉凝集試驗(yàn)37
• 3.2.3 致病性測(cè)定37-39
• 3.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定39
• 3.3 疫苗株培養(yǎng)條件及甲醛滅活濃度優(yōu)化39-42
• 3.3.1 培養(yǎng)基的選擇39-40
• 3.3.2 培養(yǎng)溫度確定40
• 3.3.3 培養(yǎng)基p H的確定40-41
• 3.3.4 培養(yǎng)時(shí)間確定41-42
• 3.3.5 甲醛滅活濃度確定42
• 3.4 候選菌株傳代穩(wěn)定性檢測(cè)42-44
• 3.4.1 傳代菌生長(zhǎng)穩(wěn)定性42-43
• 3.4.2 傳代菌致病性43
• 3.4.3 傳代菌對(duì)小鼠的免疫保護(hù)43-44
• 3.5 三價(jià)滅活菌免疫效力檢測(cè)44-49
• 3.5.1 三價(jià)滅活菌制備及檢驗(yàn)44
• 3.5.2 最小免疫劑量確定44-46
• 3.5.3 三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠免疫保護(hù)46-49
• 4 討論49-52
• 4.1 細(xì)菌的分離鑒定49
• 4.2 三價(jià)滅活菌候選菌株的選擇49-50
• 4.3 候選菌株致病性和傳代穩(wěn)定性50
• 4.4 三價(jià)滅活菌對(duì)小鼠免疫效力評(píng)估50-52
• 5 結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-63
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文63

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本文編號(hào)：1066655