本文關(guān)鍵詞：新城疫病毒強(qiáng)弱毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立及試劑盒的組裝

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【摘要】：新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒引起的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性禽類(lèi)傳染病,嚴(yán)重危害禽類(lèi)健康,其發(fā)病率和死亡率都很高。近幾年,新城疫的發(fā)病情況和流行態(tài)勢(shì)日益復(fù)雜,新城疫病毒強(qiáng)弱毒株混合感染在禽群中越來(lái)越常見(jiàn),區(qū)分新城疫病毒強(qiáng)弱毒株在新城疫診斷與防控上也越來(lái)越受到重視。常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新城疫強(qiáng)、弱毒的方法耗時(shí)耗力難以滿足需求,如雞胚平均死亡時(shí)間(MDT)、6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)等。與這些方法相比熒光定量RT-PCR方法省時(shí)省力、操作簡(jiǎn)便、安全可靠,并且特異性、敏感性?xún)?yōu)異。近年來(lái),國(guó)外雖有利用多重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法區(qū)分新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的研究,但國(guó)外新城疫流行株的基因型與我國(guó)當(dāng)前新城疫流行株的基因型(Ⅶ型)存在著一定的差異。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還未出現(xiàn)快速鑒別新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的試劑盒,因此建立熒光定量RT-PCR檢測(cè)新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株的方法及組裝試劑盒迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比對(duì)新城疫病毒強(qiáng)、弱毒株F基因序列,根據(jù)其在F0裂解位點(diǎn)的差異以及F基因保守序列設(shè)計(jì)了數(shù)對(duì)探針和引物。通過(guò)篩選兩組探針及引物,選擇NDV-F和NDV-R作為最佳引物組,NDV-V-Probe和NDV-L-Probe作為最佳的探針組;確定最佳的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系,其中最佳退火溫度為56℃,NDV-F、NDV-R的終濃度為0.6μM,NDV-V-Probe、NDV-L-Probe的終濃度分別為0.6μM和0.2μM。建立了新城疫病毒強(qiáng)、弱毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法,根據(jù)所建立的檢測(cè)方法組裝成試劑盒,檢驗(yàn)試劑盒的特異性、敏感性、重復(fù)性等參數(shù),并確定試劑盒的保存期和保存條件。該實(shí)驗(yàn)所建立的方法以及根據(jù)該方法組裝的試劑盒對(duì)NDV NA-1株RNA標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量均為102copies/μL,對(duì)NDV La Sota株RNA標(biāo)準(zhǔn)品的最小檢出量均為101copies/μL,用組裝成的試劑盒檢測(cè)臨床樣品,陽(yáng)性檢出率高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)新城疫RT-PCR方法,具有良好的應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 熒光定量RT-PCR 診斷 試劑盒
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-9
• 引言9-10
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述10-25
• 第1章 新城疫概述10-18
• 1.1 歷史回顧10
• 1.2 病原學(xué)10-12
• 1.3 分子流行病學(xué)12-13
• 1.4 臨床癥狀及病變13-14
• 1.5 致病機(jī)理14
• 1.6 防制及疫苗發(fā)展趨勢(shì)14-18
• 第2章 新城疫診斷技術(shù)18-24
• 2.1 病毒的分離與鑒定18
• 2.2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)18-20
• 2.3 分子生物學(xué)技術(shù)20-24
• 研究的目的與意義24-25
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容25-45
• 第1章 新城疫病毒強(qiáng)、弱毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測(cè)方法的建立25-37
• 1.1 材料25
• 1.2 方法25-28
• 1.3 結(jié)果28-34
• 1.4 討論34-35
• 1.5 小結(jié)35-37
• 第2章 試劑盒的組裝及應(yīng)用37-45
• 2.1 材料37
• 2.2 方法37-38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-43
• 2.4 討論43-44
• 2.5 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介51-53
• 作者簡(jiǎn)介53-54
• 致謝54

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