本文關鍵詞：抗豬流行性腹瀉病毒豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構建、表達及活性鑒定

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【摘要】：目前,市場上預防豬流行性腹瀉的主要疫苗均為弱毒苗和滅活苗,2010年冬季以來,豬流行性腹瀉在我國又開始了爆發(fā)流行,即使是商品化的疫苗也難以快速控制該病的發(fā)展,說明主動免疫在免疫系統(tǒng)發(fā)育不健全的仔豬上難以發(fā)揮保護作用,因此,利用基因工程手段研發(fā)新型重組抗體進行被動免疫就成為了另外一個選擇。本文在前人開發(fā)的抗PEDV雜交瘤細胞2D1的基礎上,通過提取雜交瘤細胞總RNA,反轉錄獲得全套cDNA,以此為模板,利用17對引物擴增重鏈可變區(qū)基因,利用19對引物擴增輕鏈可變區(qū)基因,篩選出2株VH序列和1株VL序列以及特異性擴增抗體可變區(qū)引物;另一方面,將原核表達的PEDV S1蛋白免疫昆明白鼠,獲得陽性抗血清,提取脾細胞的總RNA,反轉錄全套cDNA,以此為模板,利用篩選出的特異性引物擴增抗體VH序列和VL序列,其中一株重鏈可變區(qū)單克隆SH2與雜交瘤細胞中抗體重鏈可變區(qū)基因序列VH5 100%相同,一株輕鏈可變區(qū)單克隆SL2與雜交瘤細胞中抗體輕鏈可變區(qū)基因序列VL匹配率達到97.18%,由此可以確定抗PEDV抗體的VH序列(366bp)和VL序列(354bp);與此同時,通過提取豬脾細胞總RNA,反轉錄全套cDNA,以此為模板,利用特異性引物擴增獲得抗體Fc序列(363bp);通過SOE-PCR方法拼接得到單鏈抗體scFv(765bp)和scFv-Fc(1128bp),經過IgBlast分析后,兩種單鏈抗體均具有典型結構域,構建原核表達載體pEASY-scFv和pET28a-sc Fv-Fc,通過原核表達系統(tǒng)對其進行分別表達,理論分子量分別為32KDa和45.8kDa,利用SDS-PAGE和Western-Blot方法對表達產物進行鑒定,通過間接Elisa鑒定該重組蛋白與PEDV的結合活性;最后,利用HRP anti-lebeled 6×His和HRP Goat anti-Swine兩種抗體對scFv和sc Fv-Fc進行雜交。結果表明,通過原核表達產生的兩種重組抗體均具有抗原結合活性,包含F(xiàn)c段的sc Fv-Fc具有能被Goat anti-Swine抗體識別的特性,該研究為針對PEDV的重組抗體的研究奠定了理論基礎,使用豬源Fc段對單鏈抗體的種屬特異性進行了改造,具有較為深遠的實際應用意義。
【關鍵詞】：豬流行性腹瀉 單鏈抗體 基因工程 SOE-PCR Western-Blot
【學位授予單位】：河南農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 致謝4-8
• 中文摘要8-9
• 英文縮略詞表9-10
• 1 文獻綜述10-16
• 1.1 豬流行性腹瀉病毒研究進展10-11
• 1.1.1 豬流行性腹瀉概述10
• 1.1.2 豬流行性腹瀉病毒概述10
• 1.1.3 PEDV疫苗的研究進展10-11
• 1.1.4 疫苗在PEDV防治過程中的不足11
• 1.2 單鏈抗體研究進展11-16
• 1.2.1 免疫球蛋白簡介11-12
• 1.2.2 抗體的發(fā)展歷程12-13
• 1.2.3 單鏈抗體簡介13-14
• 1.2.4 單鏈抗體在原核表達系統(tǒng)中的表達14
• 1.2.5 單鏈抗體在真核表達系統(tǒng)中的表達14
• 1.2.6 豬源化嵌合單鏈抗體14-16
• 2 引言16-17
• 3 材料與方法17-43
• 3.1 實驗材料17-20
• 3.1.1 菌株、載體、質粒及相關蛋白17
• 3.1.2 實驗相關動物及組織17
• 3.1.3 雜交瘤細胞17
• 3.1.4 主要試劑及試劑盒17-18
• 3.1.5 主要實驗儀器設備18-19
• 3.1.6 常用溶液配方19-20
• 3.2 實驗方法20-43
• 3.2.1 從雜交瘤細胞中擴增抗體可變區(qū)基因20-26
• 3.2.2 小鼠免疫及抗體基因的克隆26-28
• 3.2.3 豬IgG Fc的克隆28-29
• 3.2.4 單鏈抗體基因scFv的構建、表達及檢測29-38
• 3.2.5 豬源化單鏈抗體基因scFv-Fc的構建、表達及檢測38-42
• 3.2.6 Western-Blot反應檢測scFv蛋白和sc Fv-Fc蛋白的種屬特異性42-43
• 4 結果與分析43-62
• 4.1 從雜交瘤細胞中擴增抗體基因43-47
• 4.1.1 雜交瘤細胞總RNA的提取及反轉錄cDNA43
• 4.1.2 擴增抗體重鏈可變區(qū)43-44
• 4.1.3 擴增抗體輕鏈可變區(qū)44-45
• 4.1.4 抗PEDV抗體重鏈可變區(qū)基因的序列測定及分析45-46
• 4.1.5 抗PEDV抗體輕鏈可變區(qū)基因的序列測定及分析46-47
• 4.2 從免疫小鼠脾臟中擴增抗體基因47-50
• 4.2.1 小鼠免疫47
• 4.2.2 小鼠脾臟總RNA提取及反轉錄cDNA47-48
• 4.2.3 確定抗PEDV抗體重鏈可變區(qū)基因和輕鏈可變區(qū)基因序列48-50
• 4.3 單鏈抗體基因scFv的構建、表達及鑒定50-55
• 4.3.1 SOE-PCR法構建scFv50-51
• 4.3.2 表達載體pEASY-scFv構建51
• 4.3.3 表達載體pEASY-scFv誘導表達51
• 4.3.4 IPTG誘導劑量與表達效率的關系51-52
• 4.3.5 IPTG誘導時間與表達效率的關系52-53
• 4.3.6 IPTG誘導溫度與表達效率的關系53
• 4.3.7 Western-Blot檢測目的蛋白53
• 4.3.8 目的蛋白的純化53-54
• 4.3.9 Elisa檢測54-55
• 4.4 豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構建、表達及鑒定55-60
• 4.4.1 SOE-PCR法構建scFv-Fc55
• 4.4.2 pMD19-T-scFv-Fc和pET28a雙酶切55-56
• 4.4.3 菌液PCR檢測及單酶切鑒定56-57
• 4.4.4 IPTG誘導劑量與表達效率的關系57
• 4.4.5. IPTG誘導時間與表達效率的關系57-58
• 4.4.6 IPTG誘導溫度與表達效率的關系58-59
• 4.4.7 確定目的蛋白表達形式59
• 4.4.8 Western-Blot檢測目的蛋白59
• 4.4.9 目的蛋白純化59-60
• 4.4.10 Elisa檢測60
• 4.5 Western-Blot檢測scFv和scFv-Fc單鏈抗體60-62
• 5 小結與討論62-64
• 5.1 小結62
• 5.2 討論62-64
• 參考文獻64-70
• 附錄:scFv-Fc基因序列70-72
• 作者讀研期間發(fā)表文章72-73
• abstract73

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