本文關(guān)鍵詞：麝香草酚對金葡菌誘發(fā)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護作用及機制

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【摘要】：奶牛乳腺炎是一種給奶牛養(yǎng)殖業(yè)和乳品行業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失的主要疾病之一。它是一種由于物理、化學(xué)、病原微生物等刺激因素導(dǎo)致乳腺組織發(fā)生炎性反應(yīng)疾病。奶牛乳腺炎發(fā)生后,乳腺組織的損傷往往引起奶牛產(chǎn)奶量減少和乳品質(zhì)下降,嚴(yán)重時導(dǎo)致奶牛乳腺泌乳停止,產(chǎn)奶機能喪失,甚至奶牛遭淘汰。與臨床型奶牛乳腺炎相比,隱性乳腺炎發(fā)病后除體細(xì)胞升高外,概無其它癥狀,單憑臨床檢查難以得到確診,同時又因其著較高的發(fā)病率,往往造成的經(jīng)濟損失更為嚴(yán)重。金葡菌是引起隱性奶牛乳腺炎的重要病原之一,作為一種傳染性的病原微生物,金葡菌通常被認(rèn)為是一種胞外病原體,但有研究表明它能侵入乳腺上皮細(xì)胞并且在胞內(nèi)存活,引起奶牛乳腺組織慢性、持續(xù)性感染,金葡菌本身具有很強的耐藥性,再加上能夠侵入細(xì)胞內(nèi)存活,而使用抗生素治療也很難根除,往往造成奶牛乳腺炎的反復(fù)發(fā)病,而且抗生素治療極易造成藥物殘留,耐藥菌株的出現(xiàn)甚至威脅人類健康。因而,在獸醫(yī)生產(chǎn)實踐中,亟需尋找既可以治療奶牛乳腺炎又相對較安全的藥物。中草藥治療奶牛乳腺炎具有明顯的治療效果,其不僅能避免應(yīng)用抗生素導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生,而且能避免藥物殘留等問題,因而應(yīng)用中草藥治療奶牛乳腺炎一直被寄予厚望。麝香草酚是一種來源于百里香屬和牛至屬等傳統(tǒng)中醫(yī)藥成分的單萜酚類天然化合物,因為其具有抗炎、抗寄生蟲、抗氧化等生物活性,已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和獸醫(yī)領(lǐng)域。但麝香草酚對金葡菌引起的奶牛乳腺炎影響還不清楚,本論文以麝香草酚為研究對象,通過分離培養(yǎng)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bMEC)建立金葡菌體外感染模型,研究麝香草酚對金葡菌誘導(dǎo)bMEC炎癥反應(yīng)的保護作用及其機制,為臨床應(yīng)用麝香草酚治療奶牛乳腺炎提供實驗數(shù)據(jù)及參考。首先,建立金葡菌感染體外模型,觀察了麝香草酚對金葡菌誘發(fā)的奶牛乳腺炎的保護作用。分光光度計法和MTT法分別檢測麝香草酚對金葡菌和bMEC生長的影響;qRT-PCR法檢測金葡菌誘導(dǎo)的bMEC炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況;最后,利用westernblotting法檢測了麝香草酚對炎性細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的NF-κB與MAPK信號通路的影響,以求初步闡述麝香草酚對金葡菌刺激的bMEC炎癥反應(yīng)保護作用的機制。結(jié)果顯示,麝香草酚(16~64ug/ml)既不會影響金葡菌的生長,也不會對奶牛乳腺上皮細(xì)胞有毒性作用,而麝香草酚會劑量依賴性的降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá),說明麝香草酚對金葡菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎具有明顯的保護作用。進一步的Westernblotting結(jié)果顯示,麝香草酚可以顯著地抑制與炎性細(xì)胞因子表達(dá)相關(guān)的p65、p38、JNK和ERK等關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平,說明麝香草酚對金葡菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的保護作用是通過抑制NF-κB與MAPK信號通路實現(xiàn)的。其次,為了進一步研究麝香草酚對金葡菌刺激的bMEC炎癥反應(yīng)的保護作用機制,檢測麝香草酚對bMEC吞噬金葡菌的影響,并探索其可能存在的機制。利用分光光度計法和MTT法分別檢測麝香草酚對金葡菌生長和bMEC生長的影響;通過慶大霉素保護實驗檢測了麝香草酚對金葡菌侵入bMEC影響;為了探索麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC可能的機制,通過實時熒光定量法、Greiss法和westernblotting法分別檢測麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的抗菌肽TAP和BNBD5表達(dá)情況、NO產(chǎn)生的情況以及NF-κB活性的影響。結(jié)果顯示,麝香草酚在16~64ug/ml濃度范圍內(nèi)對金葡菌的生長沒有影響,并且對bMEC也沒有毒性作用。慶大霉素試驗結(jié)果顯示,與空白對照組相比,麝香草酚劑量依賴性地抑制金葡菌侵入bMEC的數(shù)量,而其機制可能與抑制NF-κB活性關(guān)系較大。為了驗證推測,我們在有無NF-κB抑制劑SN50情況下,檢測bMEC吞噬金葡菌的慶大霉素保護實驗,結(jié)果顯示,抑制劑SN50顯著抑制金葡菌侵入bMEC的數(shù)目,說明麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC確實與抑制NF-κB活性相關(guān)。綜上所述,我們初步揭示了麝香草酚對金葡菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺炎的保護作用機制,一方面是通過抑制炎癥信號通路而發(fā)揮抗炎作用,另一方面是通過抑制金葡菌的侵入bMEC而發(fā)揮保護作用。
【關(guān)鍵詞】：奶牛乳腺炎 金葡菌 麝香草酚 NF-κB MAPK
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.23
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 引言13-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-26
• 第一章 奶牛乳腺炎研究進展14-23
• 1.1 奶牛乳腺炎的危害14-16
• 1.1.1 發(fā)病率高14
• 1.1.2 產(chǎn)奶量和質(zhì)量下降14-15
• 1.1.3 經(jīng)濟損失嚴(yán)重15
• 1.1.4 食品安全問題15-16
• 1.2 奶牛乳腺炎的病因16-19
• 1.2.1 病原微生物感染16-19
• 1.2.2 環(huán)境因素19
• 1.2.3 遺傳因素19
• 1.2.4 飼養(yǎng)管理因素19
• 1.3 奶牛乳腺炎的分類19-20
• 1.3.1 臨床型奶牛乳腺炎20
• 1.3.2 隱性奶牛乳腺炎20
• 1.4 奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療20-23
• 1.4.1 奶牛乳腺炎的預(yù)防20-21
• 1.4.2 奶牛乳腺炎的治療21-23
• 第二章 麝香草酚的理化性質(zhì)及藥理作用23-26
• 2.1 麝香草酚的理化性質(zhì)23
• 2.2 麝香草酚的藥理作用23-26
• 2.2.1 抗炎作用23-24
• 2.2.2 免疫調(diào)節(jié)作用24
• 2.2.3 抗氧化作用24
• 2.2.4 抗菌作用24
• 2.2.5 防腐作用24-25
• 2.2.6 其他藥理作用25-26
• 第二篇 實驗部分26-51
• 第一章 麝香草酚對金葡菌刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞NF-ΚB和MAPKS信號通路的調(diào)節(jié)作用26-42
• 1.1 材料26-29
• 1.1.1 實驗動物及實驗菌株26-27
• 1.1.2 主要試劑及藥品27
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備27-28
• 1.1.4 所需試劑的配制28-29
• 1.2 方法29-35
• 1.2.1 原代bMEC分離與培養(yǎng)29-30
• 1.2.2 原代bMEC的鑒定30
• 1.2.3 金葡菌培養(yǎng)及菌落計數(shù)30-31
• 1.2.4 麝香草酚對金葡菌生長曲線和bMEC生長的影響31
• 1.2.5 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 表達(dá)的影響31-33
• 1.2.6 麝香草酚對金葡菌刺激bME的NF-κB和MAPK信號通路關(guān)鍵接頭蛋白的影響33-35
• 1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計35
• 1.4 結(jié)果35-40
• 1.4.1 奶牛原代乳腺上皮細(xì)胞鑒定35-36
• 1.4.2 金葡菌計數(shù)36-37
• 1.4.3 麝香草酚對金葡菌生長曲線和乳腺上皮細(xì)胞生長的影響37
• 1.4.4 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的TNF-α、IL-1β 和IL-6 基因水平表達(dá)的影響37-38
• 1.4.5 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的NF-κB信號通路的影響38-39
• 1.4.6 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的MAPK信號通路的影響39-40
• 1.5 討論40-41
• 1.6 小結(jié)41-42
• 第二章 麝香草酚對BMEC吞噬金葡菌的影響42-51
• 2.1 材料42-43
• 2.1.1 實驗菌株和細(xì)胞42
• 2.1.2 主要試劑及藥品42
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備42
• 2.1.4 所需試劑的配制42-43
• 2.2 方法43-44
• 2.2.1 麝香草酚對金葡菌生長曲線和bMEC生長的影響43
• 2.2.2 慶大霉素保護試驗43
• 2.2.3 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的抗菌肽TAP和BNBD5表達(dá)的影響43-44
• 2.2.4 麝香草酚對bMEC的NO產(chǎn)生的影響44
• 2.2.5 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的NF-κB活性影響44
• 2.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計44-45
• 2.4 結(jié)果45-49
• 2.4.1 麝香草酚對金葡菌生長曲線和bMEC生長的影響45
• 2.4.2 麝香草酚抑制金葡菌侵入bMEC45-46
• 2.4.3 麝香草酚對bMEC中抗菌肽TAP和BNBD5表達(dá)的影響46-47
• 2.4.4 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的NO表達(dá)量的影響47
• 2.4.5 麝香草酚對金葡菌刺激bMEC的NF-κB活性的影響47-49
• 2.5 討論49-50
• 2.6 小結(jié)50-51
• 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-59
• 導(dǎo)師簡介59-61
• 作者簡介61-63
• 致謝63

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本文編號：1057695