本文關(guān)鍵詞：南方黃牛生長發(fā)育及其垂體組織轉(zhuǎn)錄組分析

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【摘要】：本研究在測定分析南方黃牛體重、體尺等生長性狀及血漿中生長發(fā)育類激素水平的基礎(chǔ)上,運用轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)篩選差異表達基因,最后進行實時熒光定量PCR驗證,旨在進一步發(fā)掘南方黃牛生長發(fā)育關(guān)鍵基因及探索其調(diào)控機制。選取1周歲的云南文山牛、云嶺牛(BMY牛)、西門塔爾牛各5頭,按常規(guī)育肥方法進行飼養(yǎng),日糧按精粗比(DM)65%：35%搭配,日采食量以牛只2.2%體重提供(DM),在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下進行6個月的育肥試驗。在育肥期間測定體重、體尺,并利用Elisa法測定血漿中生長發(fā)育類激素水平。屠宰后采集每頭牛的垂體組織,利用RNA-seq高通量測序技術(shù)對試驗牛垂體組織進行深度轉(zhuǎn)錄組測序,利用Q-PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進行驗證分析。主要結(jié)果如下：1.研究發(fā)現(xiàn)3個品種肉牛同齡體重大小順序為：西門塔爾牛云嶺牛文山牛,且每個月齡西門塔爾牛和云嶺牛體重都極顯著大于文山牛(P0.01)。1.5周歲時,文山牛體高、體長、胸圍、管圍等體尺顯著小于西門塔爾牛及云嶺牛(P0.05)；文山牛血漿中生長激素(GH)、甲狀腺激素(T4)、甲狀腺激素(T3)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、胰島素(INS)及促甲狀腺激素(TSH)水平顯著低于云嶺牛(P0.05),其中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、生長激素(GH)及甲狀腺激素(T3)水平也顯著低于西門塔爾牛(P0.05)。2.對3個品種肉牛垂體組織進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。以西門塔爾牛為對照,文山牛垂體組織中共檢測到1733個差異表達基因,其中944個基因下調(diào)表達,789個基因上調(diào)表達,這些基因被注釋到3779條GO term中；云嶺牛垂體組織中共檢測到1275個差異表達基因,其中521個基因上調(diào)表達,754個基因下調(diào)表達,這些基因被注釋到3214條GO term中。以云嶺牛對照,文山牛垂體組織中共檢測到1789個差異表達基因,其中817個基因下調(diào)表達,972個基因上調(diào)表達,這些基因被注釋到4129條GO term中(FC2,P0.05)。3.通過轉(zhuǎn)錄組KEGG富集分析,共篩選到生長發(fā)育相關(guān)通路25條,主要包括HIPPO信號通路(Hippo signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、 MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、RAP1信號通路(Rap 1 signaling pathway)、 Ras信號通路(Ras signaling pathway)、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工(Protein processing inendoplasmic reticulum)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Neurotrophin signaling pathway)、細胞周期(Cell cycle)、FOXO信號通路(Foxo signaling pathway)、干細胞多能性信號通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)等。這些通路的變化可能跟南方黃牛的生長發(fā)育密切相關(guān),例如神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中富集的促甲狀腺激素釋放激素基因(TRH)在文山牛垂體組織處于下調(diào)狀態(tài),與之相反,TRH基因在西門塔爾牛和云嶺牛垂體組織處于上調(diào)狀態(tài),這可能刺激了促甲狀腺激素釋放激素在西門塔爾牛和云嶺牛中的表達,進而促進西門塔爾牛和云嶺牛生長發(fā)育。再如,神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中富集的生長抑素受體基因(SSTR5)在文山牛垂體組織處于上調(diào)狀態(tài),在西門塔爾牛和云嶺牛垂體組織處于下調(diào)狀態(tài),這可能刺激了生長抑素受體在文山牛體內(nèi)的表達,從而使生長抑素作用增強,進而抑制生長激素、促甲狀腺激素的作用,導(dǎo)致文山牛體型較小,生長發(fā)育慢。4.將篩選到的與生長發(fā)育相關(guān)功能基因進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析,共發(fā)現(xiàn)35個樞紐基因,主要包括BMPR1B、TGFB2、BDNF、FIGF、CCNB1、CNTFR、CDKN2B、SSTR2、NGFR、 PDGFC、JAG2、TNFRSF11B、PRLR、MAPK12、SSTR5、CDK6、FGF20、GAS1、GHRHR、 TSHR、CKB、BMP6、CDKL5等。5.挑選8個顯著差異表達的基因(GHRHR、JAG1、LRG1、FAM92B、LOC404103、CRYM、 BDNF、SLC2A4),利用Q-PCR技術(shù)對其進行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個品種牛垂體組織的Q-PCR與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長因子、生長激素、甲狀腺激素和促甲狀腺激素及其功能相關(guān)差異表達基因(TTR、TSHR、TRH、SSTR5、SSTR2、IGFBP4、IGFBP5等)與南方黃牛生長發(fā)育密切相關(guān)；上述基因,同時與HIPPO信號通路、MAPK信號通路、Ras信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細胞周期信號通路等多條生長發(fā)育相關(guān)信號通路中富集的REC8、BDNF、BMPR1B、MAP2K7、NGFR、TGFB2、BMP7、CDC20和FGF1等基因,可作為南方黃牛生長發(fā)育研究候選基因群。
【關(guān)鍵詞】：南方黃牛 生長發(fā)育 生長發(fā)育類激素 垂體組織 轉(zhuǎn)錄組測序
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823.81
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-10
• 第一章 文獻綜述10-15
• 1 我國肉牛產(chǎn)業(yè)狀況10
• 2 我國南方黃牛遺傳資源特點10-11
• 3 制約生長發(fā)育相關(guān)激素簡述11-12
• 4 轉(zhuǎn)錄組及轉(zhuǎn)錄組技術(shù)簡述12-14
• 4.1 轉(zhuǎn)錄組研究的重要意義12-13
• 4.2 轉(zhuǎn)錄組測序平臺13
• 4.3 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在動物上的應(yīng)用13-14
• 5 本研究目的及意義14-15
• 第二章 南方黃牛生長發(fā)育分析15-25
• 1 南方黃牛體重及體尺性狀分析15-19
• 1.1 試驗材料15
• 1.2 飼養(yǎng)管理15
• 1.3 南方黃牛體重及體尺測定15-18
• 1.3.1 測量工具15-16
• 1.3.2 測定指標及方法16
• 1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計16
• 1.3.4 試驗結(jié)果16-18
• 1.4 討論18-19
• 2 南方黃牛生長發(fā)育類激素水平分析19-25
• 2.1 試驗儀器19-20
• 2.2 試驗方法20-21
• 2.2.1 樣品采集20
• 2.2.2 激素測定20
• 2.2.3 數(shù)據(jù)處理20-21
• 2.3 試驗結(jié)果21-23
• 2.3.1 南方黃牛生長發(fā)育類激素水平比較21-22
• 2.3.2 南方黃牛激素水平變化結(jié)果22-23
• 2.4 討論23-25
• 第三章 南方黃牛垂體組織轉(zhuǎn)錄組分析25-64
• 1. 試驗材料25-27
• 1.1 試驗動物和樣品的采集25
• 1.2 主要儀器25-26
• 1.3 主要試劑26
• 1.4 主要數(shù)據(jù)庫26
• 1.5 主要軟件26-27
• 2. 試驗步驟27-30
• 2.1 總RNA提取27
• 2.2 RNA質(zhì)量檢測27
• 2.3 cDNA文庫的制備與測序27-28
• 2.4 實時熒光定量PCR驗證28-30
• 2.4.1 RNA的提取與質(zhì)量檢測28
• 2.4.2 RNA的質(zhì)量檢測28
• 2.4.3 cDNA反轉(zhuǎn)錄28-29
• 2.4.4 熒光定量PCR反應(yīng)29-30
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析30-32
• 3.1 參考序列比對分析30
• 3.2 基因表達量分析30
• 3.3 差異表達基因的篩選30-31
• 3.4 差異表達基因的基因本體論(GO)功能分析31
• 3.5 差異表達基因KEGG通路分析31-32
• 4. 結(jié)果及分析32-59
• 4.1 總RNA質(zhì)量檢測32
• 4.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估32-36
• 4.2.1 測序錯誤率分布檢查32-35
• 4.2.2 測序數(shù)據(jù)的過濾35-36
• 4.3 測序序列比對分析結(jié)果36-37
• 4.4 可變剪切分析37-38
• 4.5 單核苷酸多態(tài)性分析38
• 4.6 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測及基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化38-39
• 4.6.1 新轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)注釋38-39
• 4.6.2 已知基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果39
• 4.7 基因表達水平分析39-40
• 4.8 基因差異表達分析40-50
• 4.8.1 差異表達分析41-43
• 4.8.2 差異基因聚類分析43-44
• 4.8.3 差異表達基因GO分析44-50
• 4.9 KEGG富集分析50-53
• 4.10 候選基因的KEGG富集分析53-54
• 4.11 候選基因共表達相關(guān)性分析54-55
• 4.12 生長發(fā)育類激素相關(guān)基因分析55-56
• 4.13 差異表達基因的實時熒光定量PCR驗證56-59
• 4.13.1 引物設(shè)計56-57
• 4.13.2 目的基因與內(nèi)參基因的溶解曲線57
• 4.13.3 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與實時定量結(jié)果的倍數(shù)差異比較57-59
• 5. 討論59-64
• 5.1 差異表達基因的篩選59-60
• 5.2 差異表達基因GO富集分析60-61
• 5.3 差異表達基因KEGG功能富集分析61-62
• 5.4 生長發(fā)育類激素及其差異表達基因分析62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表和參與發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71-72

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本文編號：1054061