發(fā)布時(shí)間：2017-10-18 08:47

  本文關(guān)鍵詞：南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育及其垂體組織轉(zhuǎn)錄組分析

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【摘要】：本研究在測(cè)定分析南方黃牛體重、體尺等生長(zhǎng)性狀及血漿中生長(zhǎng)發(fā)育類激素水平的基礎(chǔ)上,運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析技術(shù)篩選差異表達(dá)基因,最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證,旨在進(jìn)一步發(fā)掘南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵基因及探索其調(diào)控機(jī)制。選取1周歲的云南文山牛、云嶺牛(BMY牛)、西門(mén)塔爾牛各5頭,按常規(guī)育肥方法進(jìn)行飼養(yǎng),日糧按精粗比(DM)65%：35%搭配,日采食量以牛只2.2%體重提供(DM),在相同的飼養(yǎng)環(huán)境條件下進(jìn)行6個(gè)月的育肥試驗(yàn)。在育肥期間測(cè)定體重、體尺,并利用Elisa法測(cè)定血漿中生長(zhǎng)發(fā)育類激素水平。屠宰后采集每頭牛的垂體組織,利用RNA-seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)試驗(yàn)牛垂體組織進(jìn)行深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,利用Q-PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證分析。主要結(jié)果如下：1.研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種肉牛同齡體重大小順序?yàn)椋何鏖T(mén)塔爾牛云嶺牛文山牛,且每個(gè)月齡西門(mén)塔爾牛和云嶺牛體重都極顯著大于文山牛(P0.01)。1.5周歲時(shí),文山牛體高、體長(zhǎng)、胸圍、管圍等體尺顯著小于西門(mén)塔爾牛及云嶺牛(P0.05)；文山牛血漿中生長(zhǎng)激素(GH)、甲狀腺激素(T4)、甲狀腺激素(T3)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、胰島素(INS)及促甲狀腺激素(TSH)水平顯著低于云嶺牛(P0.05),其中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、生長(zhǎng)激素(GH)及甲狀腺激素(T3)水平也顯著低于西門(mén)塔爾牛(P0.05)。2.對(duì)3個(gè)品種肉牛垂體組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。以西門(mén)塔爾牛為對(duì)照,文山牛垂體組織中共檢測(cè)到1733個(gè)差異表達(dá)基因,其中944個(gè)基因下調(diào)表達(dá),789個(gè)基因上調(diào)表達(dá),這些基因被注釋到3779條GO term中；云嶺牛垂體組織中共檢測(cè)到1275個(gè)差異表達(dá)基因,其中521個(gè)基因上調(diào)表達(dá),754個(gè)基因下調(diào)表達(dá),這些基因被注釋到3214條GO term中。以云嶺牛對(duì)照,文山牛垂體組織中共檢測(cè)到1789個(gè)差異表達(dá)基因,其中817個(gè)基因下調(diào)表達(dá),972個(gè)基因上調(diào)表達(dá),這些基因被注釋到4129條GO term中(FC2,P0.05)。3.通過(guò)轉(zhuǎn)錄組KEGG富集分析,共篩選到生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)通路25條,主要包括HIPPO信號(hào)通路(Hippo signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、 MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)、RAP1信號(hào)通路(Rap 1 signaling pathway)、 Ras信號(hào)通路(Ras signaling pathway)、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工(Protein processing inendoplasmic reticulum)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Neurotrophin signaling pathway)、細(xì)胞周期(Cell cycle)、FOXO信號(hào)通路(Foxo signaling pathway)、干細(xì)胞多能性信號(hào)通路(Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells)和神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)等。這些通路的變化可能跟南方黃牛的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),例如神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中富集的促甲狀腺激素釋放激素基因(TRH)在文山牛垂體組織處于下調(diào)狀態(tài),與之相反,TRH基因在西門(mén)塔爾牛和云嶺牛垂體組織處于上調(diào)狀態(tài),這可能刺激了促甲狀腺激素釋放激素在西門(mén)塔爾牛和云嶺牛中的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)西門(mén)塔爾牛和云嶺牛生長(zhǎng)發(fā)育。再如,神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中富集的生長(zhǎng)抑素受體基因(SSTR5)在文山牛垂體組織處于上調(diào)狀態(tài),在西門(mén)塔爾牛和云嶺牛垂體組織處于下調(diào)狀態(tài),這可能刺激了生長(zhǎng)抑素受體在文山牛體內(nèi)的表達(dá),從而使生長(zhǎng)抑素作用增強(qiáng),進(jìn)而抑制生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素的作用,導(dǎo)致文山牛體型較小,生長(zhǎng)發(fā)育慢。4.將篩選到的與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)功能基因進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,共發(fā)現(xiàn)35個(gè)樞紐基因,主要包括BMPR1B、TGFB2、BDNF、FIGF、CCNB1、CNTFR、CDKN2B、SSTR2、NGFR、 PDGFC、JAG2、TNFRSF11B、PRLR、MAPK12、SSTR5、CDK6、FGF20、GAS1、GHRHR、 TSHR、CKB、BMP6、CDKL5等。5.挑選8個(gè)顯著差異表達(dá)的基因(GHRHR、JAG1、LRG1、FAM92B、LOC404103、CRYM、 BDNF、SLC2A4),利用Q-PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種牛垂體組織的Q-PCR與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn),胰島素樣生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素、甲狀腺激素和促甲狀腺激素及其功能相關(guān)差異表達(dá)基因(TTR、TSHR、TRH、SSTR5、SSTR2、IGFBP4、IGFBP5等)與南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)；上述基因,同時(shí)與HIPPO信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期信號(hào)通路等多條生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路中富集的REC8、BDNF、BMPR1B、MAP2K7、NGFR、TGFB2、BMP7、CDC20和FGF1等基因,可作為南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育研究候選基因群。
【關(guān)鍵詞】：南方黃牛 生長(zhǎng)發(fā)育 生長(zhǎng)發(fā)育類激素 垂體組織 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S823.81
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-15
• 1 我國(guó)肉牛產(chǎn)業(yè)狀況10
• 2 我國(guó)南方黃牛遺傳資源特點(diǎn)10-11
• 3 制約生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)激素簡(jiǎn)述11-12
• 4 轉(zhuǎn)錄組及轉(zhuǎn)錄組技術(shù)簡(jiǎn)述12-14
• 4.1 轉(zhuǎn)錄組研究的重要意義12-13
• 4.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)13
• 4.3 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在動(dòng)物上的應(yīng)用13-14
• 5 本研究目的及意義14-15
• 第二章 南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育分析15-25
• 1 南方黃牛體重及體尺性狀分析15-19
• 1.1 試驗(yàn)材料15
• 1.2 飼養(yǎng)管理15
• 1.3 南方黃牛體重及體尺測(cè)定15-18
• 1.3.1 測(cè)量工具15-16
• 1.3.2 測(cè)定指標(biāo)及方法16
• 1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)16
• 1.3.4 試驗(yàn)結(jié)果16-18
• 1.4 討論18-19
• 2 南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育類激素水平分析19-25
• 2.1 試驗(yàn)儀器19-20
• 2.2 試驗(yàn)方法20-21
• 2.2.1 樣品采集20
• 2.2.2 激素測(cè)定20
• 2.2.3 數(shù)據(jù)處理20-21
• 2.3 試驗(yàn)結(jié)果21-23
• 2.3.1 南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育類激素水平比較21-22
• 2.3.2 南方黃牛激素水平變化結(jié)果22-23
• 2.4 討論23-25
• 第三章 南方黃牛垂體組織轉(zhuǎn)錄組分析25-64
• 1. 試驗(yàn)材料25-27
• 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品的采集25
• 1.2 主要儀器25-26
• 1.3 主要試劑26
• 1.4 主要數(shù)據(jù)庫(kù)26
• 1.5 主要軟件26-27
• 2. 試驗(yàn)步驟27-30
• 2.1 總RNA提取27
• 2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)27
• 2.3 cDNA文庫(kù)的制備與測(cè)序27-28
• 2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證28-30
• 2.4.1 RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)28
• 2.4.2 RNA的質(zhì)量檢測(cè)28
• 2.4.3 cDNA反轉(zhuǎn)錄28-29
• 2.4.4 熒光定量PCR反應(yīng)29-30
• 3. 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析30-32
• 3.1 參考序列比對(duì)分析30
• 3.2 基因表達(dá)量分析30
• 3.3 差異表達(dá)基因的篩選30-31
• 3.4 差異表達(dá)基因的基因本體論(GO)功能分析31
• 3.5 差異表達(dá)基因KEGG通路分析31-32
• 4. 結(jié)果及分析32-59
• 4.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)32
• 4.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估32-36
• 4.2.1 測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查32-35
• 4.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的過(guò)濾35-36
• 4.3 測(cè)序序列比對(duì)分析結(jié)果36-37
• 4.4 可變剪切分析37-38
• 4.5 單核苷酸多態(tài)性分析38
• 4.6 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)及基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化38-39
• 4.6.1 新轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)注釋38-39
• 4.6.2 已知基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化結(jié)果39
• 4.7 基因表達(dá)水平分析39-40
• 4.8 基因差異表達(dá)分析40-50
• 4.8.1 差異表達(dá)分析41-43
• 4.8.2 差異基因聚類分析43-44
• 4.8.3 差異表達(dá)基因GO分析44-50
• 4.9 KEGG富集分析50-53
• 4.10 候選基因的KEGG富集分析53-54
• 4.11 候選基因共表達(dá)相關(guān)性分析54-55
• 4.12 生長(zhǎng)發(fā)育類激素相關(guān)基因分析55-56
• 4.13 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證56-59
• 4.13.1 引物設(shè)計(jì)56-57
• 4.13.2 目的基因與內(nèi)參基因的溶解曲線57
• 4.13.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與實(shí)時(shí)定量結(jié)果的倍數(shù)差異比較57-59
• 5. 討論59-64
• 5.1 差異表達(dá)基因的篩選59-60
• 5.2 差異表達(dá)基因GO富集分析60-61
• 5.3 差異表達(dá)基因KEGG功能富集分析61-62
• 5.4 生長(zhǎng)發(fā)育類激素及其差異表達(dá)基因分析62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表和參與發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄71-72

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本文編號(hào)：1054061