發(fā)布時間：2017-10-17 10:47

  本文關(guān)鍵詞：綿羊MBL基因真核表達載體構(gòu)建及抗病相關(guān)miRNA的篩選

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【摘要】：綿羊支原體肺炎(Mycoplasma pneumonia,MP)是以咳嗽、喘氣,漸進性消瘦及慢性增生性間質(zhì)性肺炎為特征的綿羊慢性呼吸道傳染病,致病機制比較復雜,臨床診斷和防治比較困難。甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)作為天然免疫系統(tǒng)的一員,直接介導或通過凝集素途徑激活補體,在機體天然免疫防御、免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。目的:分析MBL蛋白在肺炎支原體感染引起的天然免疫中發(fā)揮的作用以及MBL蛋白在個體感染中的治療效果,驗證MBL蛋白與綿羊支原體肺炎的抗性關(guān)系。方法:(1)采集健康綿羊的肝臟,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到c DNA,設(shè)計引物擴增MBL編碼區(qū)序列。經(jīng)Eco RI和Hind III雙酶切后,MBL目的基因和真核表達載體p TT5連接,構(gòu)建綿羊MBL基因真核表達重組質(zhì)粒p TT5-MBL,轉(zhuǎn)染進CHO細胞和293細胞表達并分離純化重組MBL蛋白。依據(jù)血清MBL分離純化方法分離純化綿羊血漿來源MBL蛋白。通過氣管注射方法人工感染綿羊肺炎支原體,人工感染后每日觀察其臨床癥狀,人工感染14d時分別靜脈注射重組MBL蛋白和血漿來源MBL蛋白,觀察其臨床癥狀,蛋白注射四周后宰殺。(2)在蛋白治療-1d、7d、14d、21d、28d采集新鮮血液和血清,用ELISA方法和熒光定量PCR分析血清中MBL、TNF-α、IFN-γ、補體C1、C3、IL-2、IL-4的濃度變化和表達水平。(3)蛋白注射四周后對抗病組和易感組患病綿羊屠宰取樣,采集肝臟組織,放入液氮儲存,送生物公司進行mi RNA Hi Seq高通量測序,并對測序結(jié)果進行生物信息學分析,篩選差異mi RNA。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了綿羊MBL基因真核表達載體p TT5-MBL,表達并純化出有活性的重組MBL。成功分離純化出有活性的血漿來源MBL蛋白。人工感染組綿羊在感染后均出現(xiàn)了咳嗽、食欲減退、流鼻涕、腹瀉等支原體癥狀。綿羊肺炎支原體回收培養(yǎng),多項支原體生化鑒定和支原體PCR鑒定結(jié)果表明人工感染組綿羊均成功感染了綿羊肺炎支原體,證明人工感染成功。MBL蛋白注射后,注射蛋白后均出現(xiàn)了不同程度的體溫下降,食欲恢復,與實驗對照組相比,注射蛋白的兩組剖檢的眼觀變化和切片的病理變化可見癥狀有輕微的減輕。(2)蛋白注射后,血清中的IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C3均在短期內(nèi)有不同程度的升高,在蛋白注射14d后又逐漸降低,并且在不同時期均高于實驗對照組。血清中C1表現(xiàn)為先降后升。說明注射蛋白后機體的細胞免疫和體液免疫功能均有所增強。注射MBL蛋白后患病機體MBL、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、C1和C3表達水平均有不同程度的升高,隨后逐漸降低,說明隨著病程的發(fā)展,炎癥有所舒緩。(3)篩選出多多個免疫相關(guān)的mi RNA和信號通路。結(jié)論:(1)建立了綿羊MBL基因真核表達載體的構(gòu)建方法。(2)MBL蛋白免疫治療能短期內(nèi)減輕綿羊支原體肺炎的臨床癥狀和病理變化,增強機體的細胞免疫和體液免疫,提高機體的抗病能力,改善炎癥狀況。(3)利用高通量測序技術(shù)篩選出多個免疫相關(guān)的mi RNA和信號通路。
【關(guān)鍵詞】：真核表達載體 綿羊支原體肺炎 甘露糖結(jié)合凝集素 免疫因子 熒光定量PCR
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.26
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 主要縮略詞12-13
• 前言13-15
• 1 研究目的和意義13
• 2 論文理論依據(jù)13-14
• 3 論文總體研究思路14-15
• 第一章 文獻綜述15-25
• 1.1 綿羊支原體肺炎的研究進展15-17
• 1.1.0 病原學研究15
• 1.1.1 綿羊肺炎支原體的分類15
• 1.1.2 綿羊支原體的培養(yǎng)特性和生化特征15-16
• 1.1.3 流行病學研究16
• 1.1.4 致病機制的研究16-17
• 1.2 MBL研究進展17-20
• 1.2.1 綿羊MBL的基本結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.2 綿羊MBL的功能概況18-19
• 1.2.3 MBL與感染性疾病的相關(guān)性19
• 1.2.4 MBL免疫治療現(xiàn)狀19-20
• 1.2.5 MBL基因與綿羊支原體肺炎的相關(guān)性20
• 1.3 相關(guān)細胞因子的研究進展20-22
• 1.3.1 IL-2 的研究進展20-21
• 1.3.2 IL-4 的研究進展21
• 1.3.3 IFN的研究進展21
• 1.3.4 TNF的研究進展21-22
• 1.3.5 C1和C3的研究進展22
• 1.4 ELISA的研究進展22-23
• 1.5 熒光定量PCR的研究進展23
• 1.6 miRNA的研究進展23-25
• 第二章 綿羊MBL基因真核表達載體的構(gòu)建及MBL蛋白對患病綿羊的免疫治療25-40
• 1 材料與方法25-29
• 1.1 主要試劑和儀器25
• 1.2 試驗動物25
• 1.3 引物設(shè)計與PCR擴增25-26
• 1.4 pUC57-MBL載體構(gòu)建26
• 1.5 pTT5-MBL真核表達載體的構(gòu)建26
• 1.6 細胞培養(yǎng)26
• 1.7 細胞轉(zhuǎn)染26
• 1.8 RT-PCR分析外源基因的表達26
• 1.9 重組蛋白的純化26-27
• 1.10 SDS-PAGE和Western-blot檢測27
• 1.11 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)27
• 1.12 配體結(jié)合試驗27
• 1.13 人工感染試驗27
• 1.14 支原體分離鑒定27-28
• 1.15 綿羊肺炎支原體的PCR檢測28
• 1.16 血漿來源MBL蛋白的提取及活性檢測28-29
• 1.17 治療試驗29
• 2 結(jié)果29-38
• 2.1 真核表達載體的構(gòu)建29-31
• 2.2 CHO-MBL和 293-MBL細胞的篩選與克隆化培養(yǎng)31
• 2.3 CHO-MBL細胞 293-MBL細胞內(nèi)目的基因mRNA的表達31
• 2.4 重組MBL蛋白的SDS-PAGE和Western-blot檢測31-33
• 2.5 血漿來源MBL蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果33-34
• 2.6 ELISA結(jié)果34
• 2.7 綿羊支原體理化鑒定34
• 2.8 綿羊肺炎支原體的PCR檢測34-35
• 2.9 臨床表現(xiàn)和剖檢變化35-36
• 2.10 病理變化36-38
• 3 討論38-39
• 4 結(jié)論39-40
• 第三章 ELISA方法和熒光定量PCR檢測MBL蛋白對綿羊肺炎支原體免疫調(diào)節(jié)作用40-68
• 1 材料與方法40-45
• 1.1 試驗動物40
• 1.2 主要試劑和儀器40-41
• 1.3 試驗方法41-45
• 2 結(jié)果與分析45-64
• 2.1 MBL和各細胞因子標準曲線圖45-47
• 2.2 MBL血清水平ELISA檢測結(jié)果47-49
• 2.3 血清中IFN-γ、TNF-α、補體C1、C3、IL-2、IL-4 ELISA檢測結(jié)果49-55
• 2.4 樣品總RNA質(zhì)量檢測55
• 2.5 各引物PCR擴增結(jié)果55-57
• 2.6 熒光定量PCR結(jié)果57-64
• 3 討論64-67
• 4 結(jié)論67-68
• 第四章 高通量測序技術(shù)分析患病綿羊的差異microRNAs68-84
• 1 材料與方法68-71
• 1.1 試驗動物68
• 1.2 樣品采集68
• 1.3 總RNA提取及鑒定68
• 1.4 序列的初步分析68-69
• 1.5 生物信息學分析69
• 1.6 新miRNA預測69
• 1.7 已知miRNA差異分析69
• 1.8 熒光定量qRT-PCR驗證69-71
• 1.9 靶基因預測71
• 1.10 靶基因的GO富集和KEGG通路分析71
• 2 結(jié)果與分析71-82
• 2.1 總RNA提取結(jié)果71-72
• 2.2 Solexa測序結(jié)果72-73
• 2.3 新miRNA預測73-74
• 2.4 差異表達miRNA分析74-76
• 2.5 熒光定量驗證76-77
• 2.6 靶基因預測77-78
• 2.7 靶基因GO富集分析與KEGG分析78-81
• 2.8 miR-432組織表達譜分析81-82
• 3 討論82-84
• 全文總結(jié)84
• 創(chuàng)新點84-85
• 參考文獻85-91
• 附錄：實驗試劑配制91-93
• 致謝93-94
• 作者 簡介94-95
• 導師評閱表95

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本文編號：1048428