本文關(guān)鍵詞：貓杯狀病毒VP1抗原性分析及間接ELISA診斷方法的建立

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【摘要】：貓杯狀病毒(Feline Calicivirus,FCV)是貓和其它貓科動物的重要病原體,屬于杯狀病毒科水瘡性病毒屬成員,其核酸為單股正鏈RNA分子,病毒無囊膜,只有一個血清型。FCV多感染一歲以下的幼貓,通常導(dǎo)致急性口腔和上呼吸道傳染病,主要癥狀為口腔潰瘍、鼻炎、結(jié)膜炎、上呼吸道感染、跛行等,高致病性毒株甚至能引起貓的全身性感染,并導(dǎo)致死亡。目前,FCV的診斷方法主要有RT-PCR、免疫熒光技術(shù)、中和試驗、瓊脂擴散試驗、夾心ELISA和間接ELISA,但是目前國內(nèi)尚沒有商品化的ELISA試劑盒。間接ELISA診斷方法能為FCV感染提供準(zhǔn)確診斷,且具有簡單、快速、靈敏性高等優(yōu)勢,對該病的流行病學(xué)調(diào)查、監(jiān)測以及防控具有重要意義。VP1蛋白是FCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,分為A、B、C、D、E、F六個區(qū)域,含有多個抗原表位。為了明確FCV VP1蛋白的抗原性,獲得理想的重組抗原。本研究利用分子生物學(xué)軟件Protean對A、B、C、D、E、F六個區(qū)域進行抗原表位預(yù)測,并用Megalign軟件分析其保守性;設(shè)計引物,RT-PCR擴增目的基因,進行了原核表達和Western Blot及血清學(xué)抗原性分析。Protean軟件分析發(fā)現(xiàn)VP1基因的B區(qū)(125aa-397aa)、E區(qū)(426aa-524aa)、F區(qū)(524aa-668aa)均具有較高的抗原性,而Megalign軟件分析表明氨基酸保守性分別為B區(qū)(90.2%-100%)、E區(qū)(67.7%-100%)、F區(qū)(89%-100%),均相對保守。Western Blot證明VP1-B、VP1-E、VP1-F蛋白具有較好反應(yīng)原性,進一步血清學(xué)抗原性分析證明VP1-F蛋白具有良好的抗原性。在確定了VP1-F蛋白具有良好抗原性的基礎(chǔ)上,以此為包被抗原建立了FCV間接ELISA診斷方法。選擇優(yōu)勢抗原VP1-F作為包被蛋白抗原,進行了反應(yīng)條件優(yōu)化,并確立了陰陽性臨界值,對建立的間接ELISA方法進行特異性、重復(fù)性、敏感性評價,與血清中和試驗和間接免疫熒光試驗作比對,并對臨床血清樣品進行檢測。結(jié)果表明,抗原VP1-F的最佳包被濃度為2μg/mL,最佳包被時間為37℃2h;待檢血清最佳稀釋度為1:100,最佳作用時間為37℃1h;最佳封閉液為5%脫脂乳,最佳封閉時間為37℃1h;二抗最佳稀釋度為1:5000,最佳作用時間為37℃45min,底物最佳作用時間為4min。確立了陰陽性臨界值0.352。建立的間接ELISA診斷方法對貓皰疹病毒陽性血清、貓細(xì)小病毒陽性血清、貓傳染性腹膜炎病毒Ⅰ型陽性血清、貓傳染性腹膜炎病毒Ⅱ型陽性血清均無交叉反應(yīng),特異性良好。用同一批次和不同批次包被的酶標(biāo)板檢測質(zhì)控血清,變異系數(shù)均小于10%,重復(fù)性良好。FCV的質(zhì)控陽性血清稀釋至1:3200仍顯示為陽性,敏感性良好。與血清中和試驗符合率為95%,與間接免疫熒光試驗符合率為100%。用建立的間接ELISA診斷方法檢測從哈爾濱花鳥魚寵物市場采集到的60份貓血清樣品,抗體陽性率為88.3%。綜上所述,本研究對FCV VP1蛋白各區(qū)進行抗原表位預(yù)測和保守性分析。利用原核表達系統(tǒng)成功表達重組蛋白VP1-A、VP1-B、VP1-CD、VP1-E、VP1-F,對其進行Western Blot和血清學(xué)抗原性分析,獲得優(yōu)勢抗原VP1-F蛋白,以VP1-F作為包被蛋白建立了具有良好的特異性、重復(fù)性、敏感性的間接ELISA診斷方法,為FCV的診斷和防控奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：貓杯狀病毒 VP1截短蛋白 抗原性分析 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 符號說明10-11
• 第一章 文獻綜述11-19
• 1.1 研究進展11-12
• 1.2 FCV生物學(xué)特性12-13
• 1.2.1 病原學(xué)12
• 1.2.2 病毒基因組結(jié)構(gòu)及其編碼產(chǎn)物12-13
• 1.2.3 理化特性13
• 1.2.4 培養(yǎng)特性13
• 1.3 FCV流行病學(xué)13-14
• 1.4 診斷及檢測方法14-16
• 1.4.1 ELISA14-15
• 1.4.2 RT-PCR及熒光定量PCR15
• 1.4.3 其它檢測方法15-16
• 1.5 治療及預(yù)防16-17
• 1.6 目的意義17-19
• 第二章 貓杯狀病毒VP1衣殼蛋白的截短表達及抗原性分析19-39
• 2.1 材料與試劑19-20
• 2.1.1 材料19
• 2.1.2 試劑19
• 2.1.3 主要實驗儀器19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 FCV VP1抗原表位預(yù)測及保守性分析20
• 2.2.2 引物設(shè)計與合成20-21
• 2.2.3 FCV VP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建21-26
• 2.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化26-27
• 2.2.5 原核表達產(chǎn)物的檢測、純化及鑒定27-30
• 2.2.6 VP1截短蛋白的血清學(xué)抗原性分析30
• 2.3 結(jié)果30-36
• 2.3.1 FCV VP1抗原表位預(yù)測及保守性分析結(jié)果30-31
• 2.3.2 FCV VP1原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定31-32
• 2.3.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達、鑒定及純化結(jié)果32-35
• 2.3.4 VP1截短蛋白的血清學(xué)抗原性分析結(jié)果35-36
• 2.4 討論36-39
• 第三章 貓杯狀病毒重組間接ELISA診斷方法的建立39-51
• 3.1 材料39
• 3.1.1 血清39
• 3.1.2 主要試劑、儀器39
• 3.2 方法39-43
• 3.2.1 間接ELISA方法操作步驟39
• 3.2.2 間接ELISA檢測條件的優(yōu)化39-41
• 3.2.3 陰陽性臨界值的確立41
• 3.2.4 ELISA效果評價分析41-43
• 3.2.5 臨床血清樣品的檢測43
• 3.3 結(jié)果43-49
• 3.3.1 間接ELISA檢測條件的優(yōu)化43-46
• 3.3.2 陰陽性臨界值的確立46-47
• 3.3.3 間接ELISA效果評價分析47-49
• 3.3.4 臨床血清樣品的檢測49
• 3.4 討論49-51
• 第四章 結(jié)論51-53
• 參考文獻53-57
• 致謝57-59
• 附錄59-63
• 個人簡歷63

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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5 王，

本文編號：1047230