發(fā)布時間：2017-10-16 18:06

  本文關(guān)鍵詞：鹿源布魯氏菌外膜蛋白Omp31基因的克隆與原核表達

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【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病,主要宿主是羊、牛和豬,呈世界范圍流行,并且鹿場感染布魯氏菌的現(xiàn)象逐漸增多。近幾年來,布魯氏菌病在中國的流行呈上升趨勢,嚴重危害了畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康。目前,對易感動物進行疫苗免疫和對患病動物進行撲殺是防控布魯氏菌病的有效手段。所以,利用生物學(xué)手段研制出高效、安全的疫苗,并迅速對布魯氏菌病進行準(zhǔn)確診斷是預(yù)防布魯氏菌病的關(guān)鍵。在布魯氏菌眾多具有抗原保護作用的外膜蛋白中,Omp31作為布魯氏菌的免疫保護性抗原,能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體,是基因工程疫苗的理想候選基因,也是用于布魯氏菌臨床診斷的首選基因和蛋白。此外,外膜蛋白Omp31是布魯氏菌的毒力基因,高度保守,Omp31基因的缺失可降低布魯氏菌的毒力,所以可以通過缺失Omp31基因來研制基因缺失疫苗。本研究從疑似感染布魯氏菌的鹿病料中提取基因組DNA,經(jīng)PCR擴增和TA克隆,構(gòu)建克隆載體pMD18T-Omp31,經(jīng)轉(zhuǎn)化和提取質(zhì)粒,以及BamH I和Xho I雙酶切,將獲得的Omp31基因亞克隆至pET28a原核表達載體,構(gòu)建pET28a-Omp31原核表達載體,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21感受態(tài),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),使Omp31基因在大腸桿菌BL21感受態(tài)中表達,并經(jīng)Western Blot確定該重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示,本研究成功構(gòu)建了原核表達載體pET28a-Omp31,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),其可在大腸桿菌BL21感受態(tài)中獲得穩(wěn)定表達,Omp31重組蛋白以包涵體形式存在,鎳柱純化的蛋白濃度較高,Western Blot試驗顯示其具有良好的反應(yīng)原性。本研究成功表達和純化的Omp31重組蛋白不僅濃度較高,也具有較好的反應(yīng)原性,為進一步研制布魯氏菌的亞單位疫苗、基因缺失疫苗和ELISA診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 Omp31基因 原核表達 反應(yīng)原性
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 布魯氏菌病國內(nèi)外的流行狀況11-12
• 1.1.1 世界范圍內(nèi)的布魯氏菌病疫情11
• 1.1.2 國內(nèi)布魯氏菌病的疫情11-12
• 1.2 布魯氏菌病的病原學(xué)12-13
• 1.3 布魯氏菌的感染過程及癥狀13-14
• 1.4 布魯氏菌病疫苗的研究進展14-15
• 1.5 布魯氏菌病的診斷方法15-16
• 1.6 關(guān)于外膜蛋白Omp31的研究進展16-17
• 1.7 研究的目的和意義17-18
• 2 布魯氏菌Omp31基因的擴增及載體構(gòu)建18-28
• 2.1 材料和方法18-20
• 2.1.1 材料18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備18
• 2.1.4 溶液配制18-20
• 2.1.4.1 培養(yǎng)菌種所用溶液18-19
• 2.1.4.2 感受態(tài)細胞制備所用試劑19
• 2.1.4.3 瓊脂糖凝膠所用試劑19-20
• 2.2 實驗操作步驟20-25
• 2.2.1 pMD18T-Omp31克隆載體的構(gòu)建20-23
• 2.2.1.1 引物設(shè)計20
• 2.2.1.2 細菌的培養(yǎng)20
• 2.2.1.3 菌落PCR擴增20
• 2.2.1.4 目的片段的回收20-21
• 2.2.1.5 回收目的片段與pMD18-T載體的連接21
• 2.2.1.6 感受態(tài)細胞的制備21-22
• 2.2.1.7 轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞22
• 2.2.1.8 菌落PCR22-23
• 2.2.2 pET28a-Omp31表達載體的構(gòu)建23-25
• 2.2.2.1 質(zhì)粒抽提23-24
• 2.2.2.2 酶切24
• 2.2.2.3 目的片段的回收24
• 2.2.2.4 連接24
• 2.2.2.5 轉(zhuǎn)化24-25
• 2.2.2.6 PCR篩選、測序25
• 2.2.2.7 質(zhì)粒提取25
• 2.3 結(jié)果25-28
• 2.3.1 PCR擴增結(jié)果25-26
• 2.3.2 pMD18T-Omp31克隆載體構(gòu)建結(jié)果26
• 2.3.3 pMD18T-Omp31克隆載體雙酶切結(jié)果26-27
• 2.3.4 pET28a-Omp31克隆載體構(gòu)建結(jié)果27-28
• 3 布魯氏菌Omp31蛋白原核表達及純化28-35
• 3.1 材料和方法28-30
• 3.1.1 主要試劑28
• 3.1.2 儀器28
• 3.1.3 溶液配置28-30
• 3.1.3.1 SDS-PAGE試劑28-29
• 3.1.3.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配置29
• 3.1.3.3 蛋白純化試劑29-30
• 3.2 實驗操作步驟30-32
• 3.2.1 蛋白誘導(dǎo)30-31
• 3.2.1.1 轉(zhuǎn)化30
• 3.2.1.2 小量誘導(dǎo)30
• 3.2.1.3 大量誘導(dǎo)30-31
• 3.2.2 蛋白純化31-32
• 3.2.2.1 蛋白的變性31-32
• 3.2.2.2 Ni柱純化32
• 3.3 結(jié)果分析32-35
• 3.3.1 小量誘導(dǎo)結(jié)果32-33
• 3.3.2 超聲及純化結(jié)果33-35
• 4 Omp31蛋白的Western Blot鑒定35-39
• 4.1 材料和方法35-37
• 4.1.1 材料35
• 4.1.2 試劑35
• 4.1.3 主要儀器35
• 4.1.4 溶液配置35-36
• Western Blot所用試劑35-36
• 4.1.5 主要方法步驟36-37
• 4.1.5.1 用BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度36-37
• 4.1.5.2 Western Blot驗證蛋白活性37
• 4.2 結(jié)果分析37-39
• 4.2.1 BCA法蛋白濃度測定結(jié)果37-38
• 4.2.2 Western Blot結(jié)果38-39
• 5 討論39-41
• 6 結(jié)論41-42
• 參考文獻42-45
• 致謝45-46
• 附錄46

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本文編號：1044115