本文關(guān)鍵詞：雞XOD亞基的原核表達(dá)、定位及其在NIBV感染后的蛋白表達(dá)量分析

  更多相關(guān)文章： 黃嘌呤氧化酶 雞 NIBV Western blot 免疫組化 免疫熒光

【摘要】：黃嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase,XOD)是參與機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝的關(guān)鍵酶,研究發(fā)現(xiàn)XOD在機(jī)體內(nèi)的病理過程中也起到了重要作用。本試驗(yàn)參照GenBank中收錄的G.gallus XOD基因序列(D13221.1)設(shè)計(jì)一對引物,通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增一段XOD亞基序列(987 bp),通過基因克隆,將目的基因插入到PMD-18-T載體上。確定正確插入后,將酶切后的目的基因連接至pET-32a(+)載體,構(gòu)建雞XOD原核表達(dá)載體pET-XOD,并轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,誘導(dǎo)表達(dá)重組雞XOD蛋白。通過鎳柱親和層析的方法純化重組雞XOD蛋白,以復(fù)性濃縮后的重組雞XOD蛋白作為抗原制備抗體血清,使用間接ELISA和Western blot的方法分別確定抗體的效價(jià)和特異性。通過利用免疫組化和免疫熒光的方法,使用本試驗(yàn)中制備的多克隆抗體,定位雞XOD在肝、腎組織中的分布。通過利用Western blot相對定量蛋白的方法,檢測雞在感染腎型傳染性支氣管炎(NIBV)后腎組織中XOD和Bcl-2蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果表明:雞XOD原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功,并分離純化到了高濃度的重組雞XOD蛋白(大小約54 KDa)。用該蛋白制備的多克隆抗體效價(jià)約1:102400,可特異性地檢測雞肝組織中的XOD。免疫組化和免疫熒光檢測結(jié)果顯示雞XOD主要存在于肝、腎組織細(xì)胞胞質(zhì)之中。同時(shí),蛋白定量結(jié)果表明在雞NIBV感染后會引起腎組織中XOD和Bcl-2的蛋白表達(dá)量的顯著上升(P0.05)。本試驗(yàn)通過構(gòu)建體外高效表達(dá)XOD蛋白的方法,獲得了純度較高的重組雞XOD蛋白。并用表達(dá)的重組雞XOD蛋白制備了多克隆抗體,且使用此抗體定位了XOD在雞肝、腎組織中的分布及NIBV感染后的腎組織中XOD蛋白表達(dá)量分析,為進(jìn)一步揭示雞NIBV感染后的病理機(jī)制提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：黃嘌呤氧化酶 雞 NIBV Western blot 免疫組化 免疫熒光
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
【目錄】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-11
• 英文縮略詞表11-12
• 前言12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1 黃嘌呤氧化酶13-16
• 1.1 XOD的結(jié)構(gòu)13
• 1.2 XOD在機(jī)體的分布13
• 1.3 XOD的應(yīng)用13-15
• 1.3.1 XOD的生理功能13-14
• 1.3.2 XOD的先天免疫作用14
• 1.3.3 檢測SOD活力14
• 1.3.4 測定血清中無機(jī)磷14-15
• 1.3.5 提高利巴韋林的轉(zhuǎn)化率15
• 1.3.6 魚類新鮮度的測定15
• 1.4 XOD相關(guān)的研究進(jìn)展15-16
• 1.4.1 XOD與疾病15
• 1.4.2 XOD抑制劑的開發(fā)15-16
• 1.4.3 XOD合成菌的選育16
• 1.4.4 XOD的純化16
• 2 原核表達(dá)系統(tǒng)概述16-19
• 2.1 大腸桿菌表達(dá)載體的調(diào)控原件16-17
• 2.2 大腸桿菌表達(dá)載體的類型17-19
• 2.2.1 非融合表達(dá)載體17
• 2.2.2 融合表達(dá)載體17-18
• 2.2.3 分泌表達(dá)載體18
• 2.2.4 表面呈現(xiàn)表達(dá)載體18
• 2.2.5 帶伴侶蛋白的表達(dá)載體18-19
• 2.3 外源目的蛋白的表達(dá)形式19
• 3 禽IB的研究進(jìn)展19-21
• 3.1 IBV的分型19-20
• 3.1.1 NIBV感染后的臨床癥狀19
• 3.1.2 NIBV感染后的病理變化19-20
• 3.2 IB的預(yù)防與治療20-21
• 3.2.1 IB的預(yù)防20
• 3.2.2 IB的治療20-21
• 4 本研究的目的和意義21
• 5 研究內(nèi)容與試驗(yàn)流程21-23
• 5.1 研究內(nèi)容21-22
• 5.2 試驗(yàn)流程22-23
• 第二章 雞XOD的原核表達(dá)23-42
• 1 材料與方法23-26
• 1.1 主要試劑23-24
• 1.2 主要儀器設(shè)備24
• 1.3 試劑、培養(yǎng)基的制備24
• 1.4 瓊脂糖凝膠電泳所需試劑的制備24-25
• 1.5 SDS-PAGE試劑配制25
• 1.6 純化試劑配制25-26
• 1.7 蛋白透析復(fù)性液的配制26
• 1.7.1 透析袋處理液26
• 1.7.2 透析復(fù)性液26
• 2 實(shí)驗(yàn)方法26-32
• 2.1 雞XOD的生物信息學(xué)分析26
• 2.1.1 雞XOD信號肽位點(diǎn)的預(yù)測分析26
• 2.1.2 雞XOD抗原肽端分析26
• 2.1.3 雞XOD基因的稀有密碼子分析26
• 2.2 克隆質(zhì)粒PMD-XOD的構(gòu)建26-29
• 2.2.1 引物的設(shè)計(jì)26-27
• 2.2.2 雞肝組織RNA的提取27
• 2.2.3 cDNA的合成27
• 2.2.4 XOD基因的PCR擴(kuò)增27
• 2.2.5 XOD基因產(chǎn)物的純化27
• 2.2.6 XOD基因的克隆27-28
• 2.2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化28
• 2.2.8 克隆菌株的篩選和鑒定28-29
• 2.3 表達(dá)載體pET-XOD的構(gòu)建29-30
• 2.3.1 原核表達(dá)載體和XOD基因的制備29
• 2.3.2 XOD基因與表達(dá)載體的連接29
• 2.3.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化29
• 2.3.4 表達(dá)菌株的篩選和鑒定29-30
• 2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.4.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30
• 2.4.2 目的蛋白的大量表達(dá)30
• 2.4.3 目的蛋白表達(dá)形式的鑒定30
• 2.5 目的蛋白純化、復(fù)性及濃縮30-31
• 2.5.1 蛋白純化條件的優(yōu)化30-31
• 2.5.2 目的蛋白透析復(fù)性及濃縮31
• 2.6 SDS-PAGE分析31-32
• 3 結(jié)果與分析32-40
• 3.1 雞XOD的生物信息學(xué)分析結(jié)果32-33
• 3.1.1 雞XOD信號肽端的預(yù)測分析結(jié)果32-33
• 3.1.2 雞XOD抗原肽端分析33
• 3.1.3 雞XOD基因的稀有密碼子分析結(jié)果33
• 3.2 克隆載體PMD-XOD的構(gòu)建33-34
• 3.2.1 XOD基因的擴(kuò)增33
• 3.2.2 克隆載體PMD-XOD的篩選和鑒定33-34
• 3.3 表達(dá)質(zhì)粒pET-XOD的構(gòu)建34-37
• 3.3.1 原核表達(dá)載體及XOD基因的制備34-35
• 3.3.2 pET-XOD載體的篩選和鑒定35-37
• 3.4 重組蛋白的表達(dá)37-40
• 3.4.1 重組蛋白的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)37
• 3.4.2 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定37-38
• 3.4.3 包涵體的溶解鑒定38-39
• 3.4.4 咪唑濃度優(yōu)化39
• 3.4.5 蛋白復(fù)性濃縮后的SDS-PAGE鑒定39-40
• 4 討論40-42
• 4.1 XOD目的表達(dá)區(qū)域基因的獲取40
• 4.2 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建40-41
• 4.2.1 表達(dá)系統(tǒng)的選擇40-41
• 4.2.2 表達(dá)載體的選擇41
• 4.3 重組XOD蛋白的純化41-42
• 第三章 雞XOD多克隆抗體的制備42-50
• 1 材料與方法42-43
• 1.1 試驗(yàn)材料42
• 1.2 主要儀器42
• 1.3 ELISA試劑配制42-43
• 1.4 Western Blot試劑配制43
• 2 實(shí)驗(yàn)方法43-45
• 2.1 家兔免疫43-44
• 2.2 ELISA方法檢測抗體的效價(jià)44-45
• 2.2.1 最佳抗原包被濃度及抗體稀釋倍數(shù)的確定44
• 2.2.2 抗體效價(jià)的確定44-45
• 2.3 Western Blot分析45
• 2.3.1 雞肝組織總蛋白的提取45
• 2.3.2 雞肝組織蛋白的Western Blot檢測45
• 3 結(jié)果與分析45-47
• 3.1 最佳抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定45-46
• 3.2 抗體效價(jià)的確定46-47
• 3.3 Western Blot檢測雞肝組織總蛋白中的XOD47
• 4 討論47-50
• 4.1 重組雞XOD蛋白多克隆抗體血清的制備47-48
• 4.2 間接ELISA方法測定抗體效價(jià)48
• 4.3 Western blot鑒定抗體特異性48-50
• 第四章 雞XOD在肝、腎組織中的定位分析50-55
• 1 材料與方法50
• 1.1 試驗(yàn)材料50
• 1.2 主要儀器50
• 1.3 試劑的配制50
• 2 試驗(yàn)方法50-51
• 2.1 免疫組化檢測50-51
• 2.2 免疫熒光檢測51
• 3 結(jié)果與分析51-53
• 3.1 免疫組化檢測XOD分布52-53
• 3.2 免疫熒光檢測XOD分布53
• 4 討論53-55
• 4.1 雞肝腎組織中XOD的定位53-54
• 4.2 免疫組化和免疫熒光的優(yōu)缺點(diǎn)54-55
• 第五章 雞NIBV感染后腎XOD及BCL-2 的蛋白表達(dá)量分析55-61
• 1 材料與方法55-56
• 1.1 試驗(yàn)材料55
• 1.2 主要儀器55
• 1.3 試劑配制55-56
• 2 試驗(yàn)方法56-58
• 2.1 試驗(yàn)動物攻毒56
• 2.2 雞腎組織采集56
• 2.3 雞腎組織蛋白的提取56-57
• 2.4 雞腎組織蛋白濃度的測定57-58
• 2.4.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋57
• 2.4.1 定量檢測蛋白濃度57
• 2.4.2 Western Blot相對定量分析57-58
• 2.5 數(shù)據(jù)分析58
• 3 結(jié)果與分析58-59
• 3.1 臨床癥狀和剖檢情況58
• 3.2 腎組織總蛋白的濃度的測定58-59
• 3.3 XOD及Bcl-2 蛋白表達(dá)的相對定量59
• 4 討論59-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文68

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