本文關(guān)鍵詞：含REV-LTR基因的馬立克氏病毒活疫苗的生物安全評價及免疫效力研究

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【摘要】：雞馬立克氏病(Marek's disease, MD)是以淋巴組織增生、外周神經(jīng)麻痹和臟器、肌肉、皮膚腫瘤為特征的腫瘤性傳染病,嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。馬立克氏病病毒(MDV)在流行過程中,已經(jīng)從溫和型病毒株演進(jìn)化為強(qiáng)毒株,并出現(xiàn)了超強(qiáng)毒株。常規(guī)疫苗對強(qiáng)毒的免疫保護(hù)效果并不理想,對超強(qiáng)毒株免疫保護(hù)更是不盡人意�？茖W(xué)家利用各種方法構(gòu)建MDV候選疫苗,特別是利用基因工程研發(fā)重組疫苗成為當(dāng)前研究的熱點及突破點。目前有已經(jīng)分離到多株自然整合有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)的長末端重復(fù)序列(LTR)的馬立克氏病病毒。最近研究表明REV的LTR可能賦予這種重組病毒某種選擇性優(yōu)勢,LTR較強(qiáng)的啟動子和增強(qiáng)子作用不僅能增強(qiáng)親本病毒復(fù)制,而且不改變親本病毒毒力,從而提高疫苗免疫力,這一優(yōu)勢為利用LTR改良馬立克疫苗提供了保障。前期用MDV (JM/102W株)和REV(CSC株)混合感染鴨成纖維細(xì)胞(DEF),隨后將細(xì)胞懸浮液接種于雞,在雞的羽毛囊內(nèi)分離到一株含有LTR的重組馬立克氏病病毒,并將該病毒中的LTR的基因片段連接到含有馬立克氏病毒同源臂載體B40中,構(gòu)建了帶有LTR的供體穿梭質(zhì)粒,并與CVI988/Rispens病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),在細(xì)胞中進(jìn)行同源重組,產(chǎn)生整合有LTR的CVI988/Rispens重組馬立克氏病病毒(rMDV-LTR)。本研究對rMDV-LTR進(jìn)行生物安全評價和免疫效力試驗,期望得到免疫保護(hù)作用好而又安全的重組馬立克氏病毒活疫苗,開發(fā)一種能作為表達(dá)保護(hù)性抗原基因的活疫苗載體。1含REV-LTR基因的重組馬立克氏病毒生物學(xué)特性及感染與排毒檢測將重組MDV分別通過雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)和SPF雞的連續(xù)傳代增殖,通過PCR法鑒定LTR基因是否插入,以及確定LTR在IRS和TRS的存在,進(jìn)一步用測序的方法評價重組病毒插入基因的穩(wěn)定性。在1日齡SPF雞皮下接種重組MDV,通過非免疫同居雞的羽囊和血液進(jìn)行病毒分離、PCR檢測等評估重組病毒水平傳播能力。對1日齡雞接種重組MDV后,通過對飼料、飲水、糞便、墊料等的病毒分離、PCR檢測評估疫苗毒株在環(huán)境中的存活能力,通過對免疫雞的組織病毒分離、PCR檢測等評估重組病毒在免疫雞體內(nèi)的分布情況。試驗結(jié)果表明重組馬立克氏病病毒在CEF生長良好,以50.60 PFU/ml的病毒滴度感染CEF細(xì)胞,生長曲線結(jié)果表明,rMDV-LTR在培養(yǎng)前3 d空斑較少,在4 d空斑開始增加,在第5 d生長速度迅速加快,可持續(xù)增長到7 d。相比CVI988/Rispens母本株,在第2 d開始出現(xiàn)空斑,從第3 d開始勻速生長到第6 d生長達(dá)到高峰,隨著病毒的傳代病毒的繁殖能力不會改變。PCR及測序表明,插入片段LTR基因在傳代病毒中穩(wěn)定存在,且沒有基因突變和缺失。重組馬立克氏病毒經(jīng)SPF雞體內(nèi)傳代5代后,剖檢沒有明顯肉眼病變,內(nèi)臟組織結(jié)構(gòu)清晰,沒有明顯病理變化。重組MDV接種1日齡SPF雞,同時以母本株CVI988/Rispens做對照,非免疫同居雞的組織病毒分離和PCR檢測結(jié)果表明,重組馬立克氏病毒具備向同居非免疫雞進(jìn)行水平傳播的能力。排毒檢測試驗未從飼料、糞便、飲水及棉拭子中分離到病毒,因此重組病毒和CVI988/Rispens具有同樣的安全性。2含REV-LTR基因的重組馬立克氏病毒免疫效力研究將1日齡SPF雞分成8組,每組20只,皮下免疫0.2 mL的重組MDV,劑量分別為500 PFU/只、750 PFU/只、1000 PFU/只、2000 PFU/只和3000PFU/只,同時CVI988/Rispens母本株2000 PFU/只和3000 PFU/只(0.2 mL)作為陽性對照,PBS 0.2 mL作為陰性對照。接種10天后,各組分別以500 PFU/只(0.2 mL)的劑量接種vv MDV rMd5.攻毒后的每天跟蹤記錄各組有無臨床癥狀或死亡情況。飼養(yǎng)60天后,全部撲殺并剖檢觀察其病變。采集疑似MDV病變的組織、臟器,然后每組隨機(jī)選取5只分別取其組織、臟器做石蠟切片,HE染色,進(jìn)行病理組織學(xué)觀察,最后疫苗免疫效力由保護(hù)指數(shù)來評價。試驗結(jié)果表明攻毒對照各組死亡率為85%,其余各組精神、采食和飲水正常,內(nèi)臟組織器官和組織切片的檢查均未發(fā)現(xiàn)病理變化。因此,重組MDV與母本毒株具有相同的免疫保護(hù)效力。3含REV-LTR基因的重組馬立克氏病毒對靶動物、非靶動物的安全性評價將含REV-LTR基因的重組MDV、母本病毒CVI988/Rispens與PBS作對照,分別通過皮下注射途徑對1日齡敏感雛雞進(jìn)行一次單劑量、單劑量重復(fù)和一次大劑量免疫的安全性試驗,對1日齡雛鴨和1日齡雛鵝最大劑量免疫試驗,通過腿部肌肉注射途徑對4周齡小鼠進(jìn)行最大劑量免疫試驗。疫苗免疫后,通過對試驗動物的臨床觀察、生產(chǎn)性能測定、內(nèi)臟組織器官變化和組織切片檢查,評估重組MDV的安全性。試驗結(jié)果表明,試驗雞、鴨、鵝和小鼠疫苗接種后,各組精神、采食、飲水正常,內(nèi)臟組織器官和組織切片的檢查均未發(fā)現(xiàn)病理變化。綜上所述,重組MDV對靶動物、非靶動物具有良好的安全性。
【關(guān)鍵詞】：馬立克氏病毒 LTR 雞 鵝 鴨 生物安全評價
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 符號說明7-9
• 綜述9-16
• 第一章 重組馬立克氏病毒生物學(xué)特性及感染與排毒檢測16-31
• 1 材料16-17
• 2 方法17-21
• 3 結(jié)果21-29
• 4 討論29-31
• 第二章 重組馬立克氏病毒免疫效力研究31-39
• 1 材料31-32
• 2 方法32-33
• 3 結(jié)果33-37
• 4 討論37-39
• 第三章 重組馬立克氏病毒對靶、非靶動物的安全性評價39-48
• 1 材料39-40
• 2 方法40-41
• 3 結(jié)果41-47
• 4 討論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 全文總結(jié)54-55
• 致謝55-56

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