本文關(guān)鍵詞：副豬嗜血桿菌sapA基因的鑒定與生物學(xué)特性研究

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【摘要】：副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS),革蘭氏陰性桿菌,屬于巴斯德桿菌科嗜血桿菌屬。研究表明抗菌肽敏感基因sapA在多種革蘭氏陰性菌中對(duì)阻斷抗菌肽有重要作用,在與HPS同科同屬的流感嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌中,sapA基因已被證實(shí)是一個(gè)重要的毒力因子,而目前對(duì)于該基因在HPS的情況尚未有研究報(bào)道。本研究對(duì)從患病豬肺組織中分離到的HPS菌株H31(血清12型強(qiáng)毒菌株)進(jìn)行了sapA基因的克隆與測(cè)序,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌sapA基因編碼蛋白具有豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)和良好的抗原性;鑒定并分析了sapA基因在66株HPS中的分布情況,發(fā)現(xiàn)僅29株存在該基因,推測(cè)該基因只存在于毒力菌株中,但由于所選用菌株數(shù)量有限,該結(jié)果需進(jìn)一步確認(rèn)研究;測(cè)序并分析了29個(gè)sapA基因表明該基因在不同菌株中高度同源。構(gòu)建了sapA基因原核表達(dá)載體pET-32a(sapA)并摸索優(yōu)化了表達(dá)條件,大量表達(dá)、純化了一批具有生物學(xué)活性的sapA蛋白(濃度195μg/mL);制備了sapA蛋白兔抗高免血清并建立了間接ELISA檢測(cè)血清sapA蛋白抗體的方法;間接ELISA、western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)sapA蛋白能夠很好地識(shí)別H31血清,表明具有良好的免疫原性;間接免疫熒光法、western blot法發(fā)現(xiàn)提取的H31細(xì)菌胞質(zhì)蛋白能夠與sapA蛋白高免血清發(fā)生特異性免疫印跡反應(yīng),表明sapA蛋白存在于細(xì)菌細(xì)胞胞質(zhì)中;血清殺菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sapA蛋白血清作用下細(xì)菌存活率較陰性對(duì)照有明顯提高,表明sapA蛋白抗體促進(jìn)細(xì)菌繁殖生長;sapA蛋白阻斷試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sapA蛋白對(duì)抗菌肽殺菌有良好的阻斷作用,且阻斷后一定程度上促進(jìn)了細(xì)菌的生長,推測(cè)sapA蛋白結(jié)合了抗菌肽并將其分解成氨基酸以供細(xì)菌生長利用,促進(jìn)了細(xì)菌的生長繁殖。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高水平sapA蛋白抗體加劇了豚鼠在HPS攻毒后的發(fā)病與死亡,驗(yàn)證了血清殺菌試驗(yàn)結(jié)果,證明sapA基因是一個(gè)重要的毒力因子。本文首次對(duì)HPS的sapA基因進(jìn)行了鑒定和研究,分析、預(yù)測(cè)了其序列和編碼蛋白特性,并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體,高效表達(dá)、純化得到了一批具有生物學(xué)活性的sapA融合表達(dá)蛋白。鑒定了蛋白的免疫原性,定位了蛋白的細(xì)菌亞細(xì)胞位置,體外試驗(yàn)驗(yàn)證了sapA蛋白血清的殺菌效應(yīng)和sapA蛋白阻斷抗菌肽殺菌效應(yīng),體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證了sapA基因是HPS的一個(gè)重要的毒力因子。為以后副豬嗜血桿菌sapA基因的研究以及疫苗的開發(fā)提供參考。
【關(guān)鍵詞】：副豬嗜血桿菌 sapA基因 克隆分析 蛋白生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略 詞8-12
• 第一章 緒論12-18
• 1.1 副豬嗜血桿菌簡述12-14
• 1.1.1 病原學(xué)12
• 1.1.2 流行病學(xué)12-13
• 1.1.3 HPS毒力因子的研究13-14
• 1.2 陽離子抗菌肽與sapA基因14-16
• 1.2.1 抗菌肽的來源與結(jié)構(gòu)14-15
• 1.2.2 CAMPs的作用機(jī)制15
• 1.2.3 細(xì)菌抵御CAMPs殺滅作用的機(jī)制15-16
• 1.2.4 抗菌肽敏感（Sensitive of anti-microbial peptide, sap）基因16
• 1.3 研究目的與意義16-18
• 第二章 HPS sapA基因的克隆與分析18-31
• 2.1 前言18
• 2.2 材料與方法18-23
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-19
• 2.2.1.1 菌種18
• 2.2.1.2 試劑和材料18-19
• 2.2.1.3 儀器與設(shè)備19
• 2.2.2 方法19-23
• 2.2.2.1 副豬嗜血桿菌sapA基因的克隆19-20
• 2.2.2.2 pGEM-sapA克隆載體的構(gòu)建20-22
• 2.2.2.3 副豬嗜血桿菌sapA基因的序列測(cè)定與分析22
• 2.2.2.4 副豬嗜血桿菌sapA基因的分布與同源性分析22-23
• 2.3 結(jié)果與分析23-29
• 2.3.1 H31 Sap A基因克隆結(jié)果23
• 2.3.2 PCR產(chǎn)物回收結(jié)果23-24
• 2.3.3 重組克隆載體 31A-T的PCR鑒定結(jié)果24
• 2.3.4 重組克隆載體 31A-T的雙酶切鑒定結(jié)果24-25
• 2.3.5 副豬嗜血桿菌H31菌株sapA基因的測(cè)序與分析25-26
• 2.3.6 副豬嗜血桿菌不同菌株sapA基因的分布26
• 2.3.7 副豬嗜血桿菌不同菌株sapA基因的測(cè)序與分析26-29
• 2.4 討論29-31
• 2.4.1 sapA基因的克隆與預(yù)測(cè)分析29
• 2.4.2 sapA在不同菌株中分布情況29-30
• 2.4.3 sapA在不同菌株中同源性分析30-31
• 第三章 HPS sapA基因的原核表達(dá)、純化31-46
• 3.1 前言31
• 3.2 材料與方法31-38
• 3.2.1 材料31-32
• 3.2.1.1 菌種與載體31
• 3.2.1.2 試劑與材料31-32
• 3.2.2 方法32-38
• 3.2.2.1 試劑的配制32
• 3.2.2.2 sapA基因片段的克隆與純化32
• 3.2.2.3 原核表達(dá)載體pET32a（sapA）的構(gòu)建32-34
• 3.2.2.4 HPS sapA基因的原核表達(dá)34-36
• 3.2.2.5 融合蛋白的大量表達(dá)與純化36-37
• 3.2.2.6 包涵體純化蛋白的復(fù)性與濃縮37
• 3.2.2.7 蛋白濃度測(cè)定37-38
• 3.3 結(jié)果與分析38-44
• 3.3.1 pET-32a（sapA）原核表達(dá)載體的構(gòu)建38-40
• 3.3.1.1 pET-32a（sapA）的PCR鑒定與雙酶切鑒定38-39
• 3.3.1.2 pET-32a（sapA）轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌E.coli BL21(DE3)的PCR鑒定39-40
• 3.3.2 sapA蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)40-44
• 3.3.2.1 誘導(dǎo)溫度對(duì)sapA蛋白表達(dá)的影響40
• 3.3.2.2 IPTG濃度對(duì)sapA蛋白表達(dá)的影響40-41
• 3.3.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)sapA蛋白表達(dá)的影響41-42
• 3.3.2.4 融合表達(dá)蛋白的可溶性分析42
• 3.3.2.5 融合表達(dá)蛋白的純化42-43
• 3.3.2.6 sapA蛋白濃度測(cè)定43-44
• 3.4 討論44-46
• 第四章 HPS sapA融合表達(dá)蛋白的生物學(xué)特性研究46-65
• 4.1 前言46
• 4.2 材料與方法46-53
• 4.2.1 材料試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物46
• 4.2.2 方法46-53
• 4.2.2.1 試劑的配置46-47
• 4.2.2.2 高免血清的制備47-48
• 4.2.2.3 間接ELISA檢測(cè)sapA蛋白抗體方法的建立48-50
• 4.2.2.5 sapA蛋白的細(xì)菌亞細(xì)胞定位50-52
• 4.2.2.6 sapA蛋白高免血清殺菌試驗(yàn)52
• 4.2.2.7 sapA蛋白阻斷抗菌肽殺菌試驗(yàn)52-53
• 4.2.2.8 sapA蛋白的動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)53
• 4.3 結(jié)果與分析53-62
• 4.3.1 間接ELISA檢測(cè)sapA蛋白抗體方法的建立53-56
• 4.3.1.1 最佳抗原包被濃度、最佳血清稀釋度53-54
• 4.3.1.2 酶標(biāo)二抗最佳使用濃度54
• 4.3.1.3 陰陽性臨界值54-55
• 4.3.1.4 血清抗體水平監(jiān)測(cè)55-56
• 4.3.2 sapA蛋白的免疫原性鑒定56-57
• 4.3.2.1 ELISA分析sapA蛋白的免疫原性56
• 4.3.2.2.western blot分析sapA蛋白的免疫原性56-57
• 4.3.3 sapA蛋白的亞細(xì)胞定位57-59
• 4.3.3.1 間接免疫熒光定位細(xì)菌表面57-58
• 4.3.3.2 western blot定位細(xì)菌亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)58-59
• 4.3.4 sapA蛋白高免血清殺菌試驗(yàn)59-60
• 4.3.5 sapA蛋白阻斷抗菌肽殺菌試驗(yàn)60
• 4.3.6 sapA蛋白的動(dòng)物免疫攻毒試驗(yàn)60-62
• 4.4 討論62-65
• 4.4.1 間接ELISA檢測(cè)血清sapA蛋白抗體方法的建立62
• 4.4.2 sapA融合蛋白的免疫原性62
• 4.4.3 sapA蛋白在副豬嗜血桿菌的亞細(xì)胞定位62-63
• 4.4.4 sapA蛋白高免血清的體外殺菌效應(yīng)63
• 4.4.5 sapA蛋白阻斷抗菌肽殺菌效應(yīng)63-64
• 4.4.6 豚鼠免疫攻毒試驗(yàn)64-65
• 全文總結(jié)65-66
• 致謝66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況70-71
• 答辯委員會(huì)對(duì)論文的評(píng)定意見71-72

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本文編號(hào)：1029689