本文關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒強(qiáng)弱毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞差異蛋白的篩選及驗(yàn)證

  更多相關(guān)文章： PRRSV 強(qiáng)弱毒株 重組病毒 PAM細(xì)胞 膜蛋白 質(zhì)譜分析

【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙為特征的急性傳染病。1987年,該病在美國(guó)首次報(bào)道。2006年,中國(guó)爆發(fā)高致病性PRRS,除了經(jīng)典癥狀以外,以高致病率與高死亡率為主要特點(diǎn)。PRRSV為單股正鏈RNA病毒,屬于套式病毒目,動(dòng)脈炎病毒科,動(dòng)脈炎病毒屬;基因組在核糖體移碼框的作用下轉(zhuǎn)錄并翻譯為pp1a與pp1ab兩段多肽,并在其自身產(chǎn)生的水解酶的作用下,將這兩條多肽鏈消化產(chǎn)生多于12種非結(jié)構(gòu)蛋白,這些非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)參與結(jié)構(gòu)蛋白的合成,與此同時(shí),產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)一同協(xié)作,參與病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性,在患豬體內(nèi)病毒主要靶細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)以及不同組織的單核巨噬細(xì)胞,不同毒力的毒株感染PAM效率有顯著差異,導(dǎo)致這種差異的機(jī)制尚不清楚。本研究以高致病性PRRSV HuN4強(qiáng)毒株與其傳代致弱的HuN4-F112弱毒株為參考毒株,構(gòu)建重組EGFP-PRRSV強(qiáng)弱毒感染性克隆,感染和純化PAM,進(jìn)行定性蛋白質(zhì)譜分析;同時(shí)以其親本強(qiáng)弱毒感染宿主PAM細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行定量蛋白質(zhì)譜分析,篩選及驗(yàn)證與病毒相互作用PAM細(xì)胞膜差異蛋白,可揭示PRRSV不同毒力毒株感染細(xì)胞效率差異的分子基礎(chǔ),為PRRSV致病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。為了純化和篩選與PRRSV相互作用的宿主細(xì)胞膜蛋白,本研究首先分別構(gòu)建了含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的重組PRRSV強(qiáng)弱毒感染性克隆,作為指示病毒,為篩選及驗(yàn)證與PRRSV相互作用的PAM細(xì)胞膜蛋白提供技術(shù)支撐。以PRRSV HuN4感染性克隆以及其傳代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆為骨架,利用反向遺傳操作技術(shù),在其病毒基因組ORF1b和ORF2a之間插入egfp基因,并在外源基因3?端下游插入該病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6(TRS6),構(gòu)建重組病毒感染性分子克隆pHuN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP,并通過(guò)轉(zhuǎn)染拯救出重組病毒。在MARC-145細(xì)胞中,將重組病毒連續(xù)傳代,其外源egfp基因仍能夠持續(xù)表達(dá),表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組病毒在病毒滴度、噬斑形態(tài)、生長(zhǎng)能力等方面與親本毒無(wú)明顯差異。在獲得具有能夠持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白的重組PRRSV強(qiáng)弱毒之后,將強(qiáng)弱毒重組病毒分別感染PAM,純化PAM,提取細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行定性蛋白質(zhì)譜分析,篩選及驗(yàn)證與病毒相互作用PAM細(xì)胞膜差異蛋白。結(jié)果表明,在分選流式儀的FITC通道中,可獲得強(qiáng)弱重組病毒感染PAM而產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào),分選出重組病毒感染的PAM,獲得了純化的細(xì)胞膜蛋白,利用Shotgun方法進(jìn)行了膜蛋白定性蛋白質(zhì)譜分析,獲得的蛋白信息進(jìn)行GO注釋,并按蛋白分類分析,篩選出強(qiáng)弱毒差異蛋白93個(gè)。對(duì)選擇的5個(gè)相關(guān)蛋白進(jìn)行標(biāo)簽融合和真核上調(diào)表達(dá)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和Kexin type9對(duì)強(qiáng)毒存在抑制作用,推測(cè)為抵御PRRSV感染的宿主蛋白;Clusterin isoform x1對(duì)強(qiáng)毒的感染存在上調(diào)作用,推測(cè)可能是PRRSV感染的宿主受體蛋白。以其親本強(qiáng)弱毒感染宿主PAM細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)譜分析,篩選及驗(yàn)證了與病毒相互作用PAM細(xì)胞膜差異蛋白。結(jié)果表明,通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組分析,獲得差異蛋白95個(gè),其中確定定位在膜上26個(gè);通過(guò)Western Blot驗(yàn)證了KDEL受體以及Histone H3蛋白,發(fā)現(xiàn)與質(zhì)譜結(jié)果中強(qiáng)弱毒組檢測(cè)結(jié)果一致,證明了質(zhì)譜的可靠性;通過(guò)String analysis方法尋找強(qiáng)弱毒之間的差異感染機(jī)制,揭示了不同毒力PRRSV感染PAM的差異潛在信號(hào)通路。
【關(guān)鍵詞】：PRRSV 強(qiáng)弱毒株 重組病毒 PAM細(xì)胞 膜蛋白 質(zhì)譜分析
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 引言14-27
• 1.1 PRRSV病原學(xué)概述14-21
• 1.1.1 病毒的基因組結(jié)構(gòu)特征15
• 1.1.2 病毒的編碼的蛋白15-17
• 1.1.3 病毒感染細(xì)胞機(jī)制17-19
• 1.1.4 PRRSV進(jìn)入宿主細(xì)胞RIG-I信號(hào)通路19-20
• 1.1.5 PRRSV進(jìn)入宿主細(xì)胞TLR3信號(hào)通路20
• 1.1.6 PRRSV進(jìn)入宿主細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路20-21
• 1.2 反向遺傳操作技術(shù)21-23
• 1.2.1 RNA病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)21-22
• 1.2.2 RNA病毒反向遺傳學(xué)的研究進(jìn)展22
• 1.2.3 PRRSV反向遺傳學(xué)的研究進(jìn)展22-23
• 1.3 分選流式細(xì)胞術(shù)23-24
• 1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)的原理23
• 1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)的研究進(jìn)展23-24
• 1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)概述24-26
• 1.4.1 常用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)24-26
• 1.4.2 Shotgun定性質(zhì)譜的研究進(jìn)展26
• 1.4.3 Label-free定量質(zhì)譜的研究進(jìn)展26
• 1.5 研究目的和意義26-27
• 第二章 重組EGFP豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染性克隆的構(gòu)建27-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.1.1 病毒株27
• 2.1.2 細(xì)胞27
• 2.1.3 主要試劑27-28
• 2.1.4 主要儀器設(shè)備28
• 2.1.5 引物及設(shè)計(jì)28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 2.2.1 重組病毒感染性克隆的構(gòu)建28-29
• 2.2.2 病毒拯救及純化傳代29
• 2.2.3 重組病毒的PCR鑒定29-30
• 2.2.4 重組病毒報(bào)告基因表達(dá)的鑒定30
• 2.2.5 重組病毒的間接免疫熒光的鑒定30
• 2.2.6 重組病毒的生物學(xué)特性鑒定30-31
• 2.3 結(jié)果31-35
• 2.3.1 EGFP重組PRRSV的全長(zhǎng)克隆的構(gòu)建與感染性檢測(cè)31-33
• 2.3.2 重組病毒與親本病毒結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)分析結(jié)果33
• 2.3.3 重組病毒與親本病毒的生物學(xué)特征分析結(jié)果33-35
• 2.4 討論35-36
• 第三章與PRRSV相互作用的PAM細(xì)胞膜蛋白的篩選及驗(yàn)證36-58
• 3.1 材料36-37
• 3.1.1 病毒株36
• 3.1.2 細(xì)胞36
• 3.1.3 主要試劑36-37
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備37
• 3.2 方法37-42
• 3.2.1 PAM細(xì)胞分離培養(yǎng)37
• 3.2.2 Shotgun質(zhì)譜分析重組病毒感染PAM細(xì)胞的制備37-38
• 3.2.3 Label-free質(zhì)譜分析親本病毒感染PAM細(xì)胞的制備38
• 3.2.4 Shotgun定性質(zhì)譜分析38-39
• 3.2.5 Label-free定量質(zhì)譜分析39-41
• 3.2.6 Shotgun質(zhì)譜分析目的蛋白的過(guò)表達(dá)驗(yàn)證41-42
• 3.2.7 Label-free質(zhì)譜分析目的蛋白WB驗(yàn)證42
• 3.3 結(jié)果42-51
• 3.3.1 PAM細(xì)胞的分離培養(yǎng)42-43
• 3.3.2 重組病毒感染PAM細(xì)胞43-44
• 3.3.3 綠色熒光信號(hào)檢測(cè)44
• 3.3.4 Shotgun定性質(zhì)譜分析結(jié)果44-46
• 3.3.5 Label-free定量質(zhì)譜分析結(jié)果46-50
• 3.3.6 Shotgun質(zhì)譜分析目的蛋白的過(guò)表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果50
• 3.3.7 Label-free質(zhì)譜分析目的蛋白的WB驗(yàn)證結(jié)果50-51
• 3.4 討論51-58
• 第四章 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 致謝67-68
• 作者簡(jiǎn)介68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 劉小林;;蛋白質(zhì)組學(xué)及其研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2007年31期

2 孫志;王金勇;張建武;秦愛(ài)健;袁世山;;豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)3′末端非翻譯區(qū)中調(diào)控序列的研究[J];微生物學(xué)報(bào);2007年05期

3 陳偉;游向榮;龍強(qiáng);李燕;;蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法與技術(shù)[J];福建果樹(shù);2006年04期

4 胡志遠(yuǎn),賀福初;蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1999年03期

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本文編號(hào)：1027567