本文關(guān)鍵詞：綿羊卵母細(xì)胞CD9對其凍融后發(fā)育能力的影響

  更多相關(guān)文章： CD9 綿羊卵巢 卵母細(xì)胞 體外成熟 體外受精 免疫組化 免疫印跡 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

【摘要】：哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞冷凍保存對生物學(xué)和人類醫(yī)學(xué)的研究與發(fā)展具有十分重要的價(jià)值,可為哺乳動(dòng)物種質(zhì)資源長期保存、人類輔助受精技術(shù)等生物技術(shù)的所需試驗(yàn)提供有效技術(shù)手段。但是,卵母細(xì)胞解凍后難以與精子結(jié)合、融合受精,其主要原因可能是卵母細(xì)胞在超低溫冷凍保存過程中膜蛋白等結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化,其中跨膜蛋白的變化有可能引起精卵不能粘附在一起或精子不能穿透卵母細(xì)胞的質(zhì)膜。CD9屬于四跨膜蛋白超家族成員之一,在多種組織、細(xì)胞上廣泛表達(dá),參與精卵結(jié)合和融合等重要生命活動(dòng)。本研究以綿羊?yàn)槟Ｐ蛣?dòng)物,采用免疫熒光染色法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡法對冷凍前后GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞CD9的分布進(jìn)行定量定位分析；通過體外受精技術(shù),探討卵母細(xì)胞冷凍前后CD9表達(dá)量對精卵結(jié)合和融合能力的影響。本試驗(yàn)的主要研究結(jié)果如下：1 本研究收集和培養(yǎng)成熟的GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞分別隨機(jī)分為新鮮組和冷凍組。采用EG、DMSO和PROH聯(lián)合冷凍保護(hù)劑的冷凍液進(jìn)行冷凍不同發(fā)育期卵母細(xì)胞,探討冷凍對卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示,經(jīng)過冷凍解凍后GV期卵母細(xì)胞成熟率(31%)顯著低于新鮮組的(75%)(P0.05)。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果表明,冷凍解凍后GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞形態(tài)正常率分別為55%和70%,新鮮GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞形態(tài)正常率分別為92%和90%,兩組之間差異顯著(P0.05)。2 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測CD9蛋白在綿羊卵巢組織上的定位表達(dá)發(fā)現(xiàn),CD9在卵泡壁層顆粒細(xì)胞、卵丘顆粒細(xì)胞和細(xì)胞膜上均有表達(dá)。并且原始卵泡時(shí)期即可檢測到CD9熒光信號,隨著卵泡的發(fā)育成熟,熒光信號逐漸增強(qiáng),到達(dá)成熟卵泡時(shí)熒光信號達(dá)到最強(qiáng)。3 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CD9 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,新鮮MⅡ期卵母胞中CD9 mRNA的表達(dá)顯著增高(P0.05),其次為冷凍M Ⅱ期卵母細(xì)胞中的表達(dá)量(P0.05),冷凍GV期卵母細(xì)胞CD9 mRNA的表達(dá)量最少(P0.05)。免疫印跡法檢測CD9蛋白水平上的表達(dá)量趨勢和在冷凍解凍過程中GV期和M Ⅱ期卵母細(xì)胞CD9熒光顯示趨勢都與mRNA水平上的表達(dá)量趨勢一致,即新鮮MⅡ期卵母細(xì)胞中CD9表達(dá)量最多,其次為冷凍MⅡ期卵母細(xì)胞中的表達(dá),冷凍GV期卵母細(xì)胞上表達(dá)量最少。4 經(jīng)體外受精試驗(yàn)檢測CD9在每卵粘附精子數(shù)及精子穿透率中的影響。結(jié)果顯示為冷凍GV期經(jīng)IVM-IVF后粘附數(shù)和穿透率分別為2.9±0.6,34%；M Ⅱ期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍解凍-IVF的數(shù)據(jù)為3.5±0.1,41%。以上兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯著低于對照組的粘附數(shù)和精子穿透率(6.0±0.5,78%)(P,0.05)。
【關(guān)鍵詞】：CD9 綿羊卵巢 卵母細(xì)胞 體外成熟 體外受精 免疫組化 免疫印跡 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S826
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 縮略語表11-12
• 1 前言12-22
• 1.1 四跨膜蛋白超家族14
• 1.2 四跨膜蛋白CD9結(jié)構(gòu)及分布14-16
• 1.3 四跨膜蛋白CD9與受精關(guān)系16-17
• 1.4 四跨膜蛋白家族與Izumo17-18
• 1.5 綿羊卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存研究18-19
• 1.6 本研究目的意義19-20
• 1.7 試驗(yàn)主要內(nèi)容與技術(shù)路線20-22
• 2 超低溫冷凍對綿羊體外成熟卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和成熟影響22-27
• 2.1 試驗(yàn)材料22
• 2.1.1 組織樣品22
• 2.1.2 主要試劑22
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備22
• 2.2 方法22-24
• 2.2.1 試劑配制22-23
• 2.2.2 卵母細(xì)胞的采集和體外成熟培養(yǎng)(IVM)23
• 2.2.3 卵母細(xì)胞成熟鑒定23
• 2.2.4 卵母細(xì)胞的冷凍保存23
• 2.2.5 卵母細(xì)胞的解凍2.1.2主要儀器設(shè)備23-24
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析24
• 2.4 結(jié)果與分析24-25
• 2.5 討論25-27
• 3 CD9在綿羊卵巢組織中的定位表達(dá)27-31
• 3.1 試驗(yàn)材料27-28
• 3.1.1 組織樣品27
• 3.1.2 主要試劑27
• 3.1.3 主要儀器設(shè)備27-28
• 3.2 方法28
• 3.3 結(jié)果與分析28-29
• 3.4 討論29-31
• 4 冷凍對卵母細(xì)胞CD9的影響31-42
• 4.1 試劑材料31-32
• 4.1.1 細(xì)胞收集31
• 4.1.2 主要試劑31
• 4.1.3 主要儀器設(shè)備31-32
• 4.2 方法32-35
• 4.2.1 卵母細(xì)胞總RNA的提取32
• 4.2.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA32-33
• 4.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR33-34
• 4.2.4 卵母細(xì)胞CD9免疫熒光染色34
• 4.2.5 提取卵母細(xì)胞CD9蛋白34
• 4.2.6 卵母細(xì)胞CD9蛋白Western blot檢測34-35
• 4.3 統(tǒng)計(jì)分析35
• 4.4 結(jié)果與分析35-39
• 4.4.1 總RNA質(zhì)檢及Q-PCR檢測35-36
• 4.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果36-37
• 4.4.3 免疫印跡結(jié)果37-38
• 4.4.4 CD9蛋白免疫熒光染色結(jié)果38-39
• 4.5 討論39-42
• 5 冷凍對精卵結(jié)合的影響42-46
• 5.1 試驗(yàn)材料42-43
• 5.1.1 組織樣品42
• 5.1.2 主要試劑42
• 5.1.3 主要設(shè)備42
• 5.1.4 主要試劑的配制42-43
• 5.2 方法43
• 5.2.1 卵母細(xì)胞的采集及成熟43
• 5.2.2 體外受精43
• 5.2.3 檢測粘附率43
• 5.2.4 檢測穿透率43
• 5.3 統(tǒng)計(jì)分析43-44
• 5.4 結(jié)果與分析44
• 5.5 討論44-46
• 6 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 作者簡介54

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