發(fā)布時(shí)間：2017-10-12 15:34

  本文關(guān)鍵詞：松遼黑豬腸道內(nèi)容物及糞便總DNA提取方法對(duì)比研究及其盲腸微生物多樣性分析

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【摘要】：腸道微生物與宿主健康息息相關(guān)。腸道內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)變化直接影響著宿主的健康和畜牧業(yè)的生產(chǎn)效率。斷奶后仔豬的腸道菌群結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定,容易發(fā)生應(yīng)激反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致腹瀉和死亡。低劑量抗生素的長期使用能夠降低斷奶后仔豬的應(yīng)激反應(yīng)和腹瀉率,提高生產(chǎn)效率,但是抗生素長期使用也具有潛在的危害,如抗生素殘留、抗生素對(duì)腸道菌群及宿主健康的負(fù)面影響等,因此開發(fā)抗生素替代物意義重大。而無論是抗生素,還是抗生素替代物,腸道微生物都是其重要的作用靶點(diǎn)�？股靥娲飳�(duì)腸道微生物的影響是評(píng)價(jià)其對(duì)抗生素替代作用的重要指標(biāo)之一。腸道微生物種類繁多,腸道內(nèi)容物組成復(fù)雜�？侱NA的提取對(duì)于腸道微生物群落結(jié)構(gòu)變化、腸道微生物多樣性分析等相關(guān)研究至關(guān)重要。因此,在利用各種分子生物學(xué)技術(shù)研究腸道微生物時(shí)首先需要一種較為合適的總DNA提取方法。六神曲是由青蒿、辣蓼、蒼耳、苦杏仁、赤小豆、麥麩和面粉按一定比例混合經(jīng)自然發(fā)酵而成的曲劑,富含多種酶,如蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等,具有消食化積、健脾開胃、和中止瀉等功能。益生菌具有維持腸道正常微生物菌群、提高免疫力、提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等功能。六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑具有益生菌、中草藥和酶制劑三者共同的特性,作為抗生素替代物開發(fā)潛力巨大。本研究首次以松遼黑豬為研究對(duì)象,利用PCR-DGGE和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析比較了5種提取方法的有效性,并在此基礎(chǔ)上解析了六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑和抗生素對(duì)松遼黑豬仔豬生長性能及其盲腸微生物多樣性的影響。主要結(jié)論如下:1、5種方法提取松遼黑豬仔豬盲腸內(nèi)容物和糞便中總DNA的有效性明顯不同采用5中不同的提取方法提取松遼黑豬仔豬盲腸內(nèi)容物和糞便中總DNA,研究結(jié)果顯示:QIAamp?DNA Stool Mini Kit提取得到的DNA純度、得率和所反映的微生物多樣性最高,更適合用于松遼黑豬盲腸內(nèi)容物和糞便中總DNA提取及其微生物多樣性分析。TIANamp Stool DNA Kit和SDS高鹽提取法提取得到的DNA純度、得率和所反映的微生物多樣性較低;索萊寶糞便基因組DNA提取試劑盒和TZ裂解液提取法提取得到的DNA純度和得率最差,微生物多樣性最低,不適合用于腸道微生物總DNA提取。2、松遼黑豬仔豬盲腸內(nèi)容物的微生物群落結(jié)構(gòu)、組成與糞便中的差異明顯采用同種方法提取同一仔豬的盲腸內(nèi)容物和糞便中的總DNA,利用PCR-DGGE和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析其微生物群落結(jié)構(gòu)及組成,結(jié)果表明:盲腸內(nèi)容物和糞便微生物群落結(jié)構(gòu)不同,糞便中微生物豐富度高于盲腸內(nèi)容物。盲腸內(nèi)容物和糞便中微生物主要屬于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria);實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:盲腸內(nèi)容物和糞便中微生物群體數(shù)量存在差異。因此,在研究腸道微生物時(shí),充分了解盲腸內(nèi)容物和糞便中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,對(duì)動(dòng)物的防病和促生長具有指導(dǎo)意義。3、六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑可部分替代飼用抗生素本研究采用對(duì)比飼喂的方法,研究了不同飼料添加劑對(duì)仔豬生長性能的影響,研究結(jié)果顯示:仔豬起始體重一致,但經(jīng)過不同飼料添加劑飼喂49天后,不同處理組體重差異顯著(p0.05),抗生素組較對(duì)照組提高40.63%,六神曲組較對(duì)照組提高21.73%;不同處理組平均日增重差異顯著(p0.05),抗生素組是對(duì)照組的2.09倍,六神曲組是對(duì)照組的1.59倍;飼料轉(zhuǎn)化率六神曲組和抗生素組高于對(duì)照組;六神曲組和抗生素組仔豬嚴(yán)重腹瀉和死亡率低于對(duì)照組,且六神曲組沒有仔豬死亡。六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑具有促進(jìn)仔豬生長,提高仔豬平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率,降低仔豬嚴(yán)重腹瀉和死亡率,具有替代飼用抗生素的潛能。4、六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑可改善仔豬盲腸微生物組成不同飼料添加劑對(duì)盲腸微生物多樣性的影響,研究結(jié)果顯示:盲腸內(nèi)容物和粘液層微生物組成和相對(duì)含量有差異。六神曲復(fù)合益生菌飼料添加劑能夠提高仔豬盲腸中乳酸桿菌(Lactobacilli spp.),糞腸球菌(Enterococcus spp.)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus spp.)群體數(shù)量及厚壁菌門與擬桿菌門比例,降低腸桿菌科(Enterobacteriaceae)相對(duì)含量和大腸桿菌(Escherichia coli)群體數(shù)量,改善仔豬盲腸微生物組成、提高仔豬免疫力。
【關(guān)鍵詞】：松遼黑豬 腸道微生物 DNA提取方法 變性梯度凝膠電泳(DGGE) 實(shí)時(shí)定量PCR 盲腸內(nèi)容物 糞便
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 緒論13-27
• 1.1 松遼黑豬的研究概況13-14
• 1.2 腸道微生物14-18
• 1.2.1 腸道微生物與動(dòng)物健康14-15
• 1.2.2 豬腸道微生物15-18
• 1.3 飼料添加劑18-20
• 1.3.1 抗生素18-19
• 1.3.2 中草藥19-20
• 1.3.3 益生菌20
• 1.4 分子生物學(xué)技術(shù)在腸道微生物研究中的應(yīng)用20-24
• 1.4.1 變性梯度凝膠電泳技術(shù)21-22
• 1.4.2 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)22-24
• 1.5 腸道微生物總DNA提取方法24-26
• 1.5.1 傳統(tǒng)DNA提取方法24-25
• 1.5.2 商品試劑盒提取方法25
• 1.5.3 腸道微生物總DNA提取方法研究現(xiàn)狀25-26
• 1.6 本研究目的與意義26-27
• 第二章 盲腸內(nèi)容物和糞便中微生物總DNA提取方法比較27-62
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器28-34
• 2.2.1 主要材料和試劑28-33
• 2.2.2 主要儀器33-34
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 2.3.1 總DNA的提取34-35
• 2.3.2 總DNA的純度和得率35
• 2.3.3 巢式PCR-DGGE分析35-36
• 2.3.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析36-37
• 2.4 數(shù)據(jù)分析37
• 2.5 核酸登錄號(hào)37-38
• 2.6 結(jié)果與分析38-59
• 2.6.1 五種DNA提取方法技術(shù)特征比較38
• 2.6.2 五種DNA提取方法在盲腸內(nèi)容物微生物總DNA提取上的應(yīng)用38-49
• 2.6.3 五種DNA提取方法在糞便微生物總DNA提取上的應(yīng)用49-56
• 2.6.4 盲腸內(nèi)容物和糞便中微生物多樣性對(duì)比分析56-59
• 2.7 討論59-61
• 2.8 本章小結(jié)61-62
• 第三章 松遼黑豬仔豬生長性能及其盲腸微生物多樣性分析62-79
• 3.1 前言62-63
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器63-65
• 3.2.1 主要材料和試劑63-65
• 3.2.2 主要儀器65
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法65-67
• 3.3.1 六神曲的制備65
• 3.3.2 益生菌菌粉的制備65
• 3.3.3 六神曲和益生菌混合制劑的制備65
• 3.3.4 仔豬飼養(yǎng)管理65-66
• 3.3.5 仔豬生長性能指標(biāo)66
• 3.3.6 盲腸內(nèi)容物和粘液層中微生物總DNA的提取66-67
• 3.3.7 盲腸內(nèi)容物和粘液層中微生物的巢式PCR-DGGE分析67
• 3.3.8 盲腸內(nèi)容物和粘液層中微生物的實(shí)時(shí)定量PCR分析67
• 3.4 數(shù)據(jù)分析67
• 3.5 核酸登錄號(hào)67
• 3.6 結(jié)果與分析67-76
• 3.6.1 仔豬生長性能67-70
• 3.6.2 盲腸微生物多樣性分析70-76
• 3.7 討論76-78
• 3.8 本章小結(jié)78-79
• 第四章 總結(jié)與展望79-82
• 4.1 總結(jié)79-80
• 4.2 展望80-82
• 參考文獻(xiàn)82-90
• 作者簡介和攻讀學(xué)位期間主要研究成果90-91
• 致謝91

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