發(fā)布時(shí)間：2017-10-12 03:42

  本文關(guān)鍵詞：檢測(cè)鴨坦布蘇病毒血清抗體的膠體金免疫層析試紙條研制

  更多相關(guān)文章： 鴨坦布蘇病毒 E基因 克隆表達(dá) 血清抗體 膠體金免疫層析技術(shù)

【摘要】：本研究通過對(duì)CQWl株(GenBank登錄號(hào)：KM233707.1)鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)進(jìn)行純化、形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察后,將純化病毒滅活、免疫健康雛麻鴨,獲得鴨抗DTMUV的免疫血清；以此病毒株的核酸為模板,RT-PCR擴(kuò)增具有較強(qiáng)免疫原性的E基因,并采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)：基于E基因表達(dá)的重組蛋白,首次建立了快速檢測(cè)DTMUV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條。研究的主要內(nèi)容歸結(jié)如下：1. DTMUV的純化、形態(tài)學(xué)觀察及其高免血清制備將CQW1分離株病毒接種9日齡的健康鴨胚,收集接種48 h后死亡鴨胚的尿囊液。采用蔗糖密度梯度(60%、45%和30%)離心純化DTMUV,透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,在45%-60%蔗糖交界層,鏡下可見較多的純凈病毒粒子,大小約為50nm,具有核心、囊膜和突起結(jié)構(gòu)。將純化的病毒經(jīng)甲醛滅活,制得免疫抗原后接種健康雛鴨,雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定免疫鴨血清效價(jià),獲得效價(jià)為1:32的鴨抗DTMUV血清,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2. DTMUV截短E基因的克隆與表達(dá)將CQW1分離株的E基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,截去其跨膜區(qū)并選取免疫原性較強(qiáng)的基因片段設(shè)計(jì)特異性引物,RT-PCR擴(kuò)增截短E基因,將其克隆至pET-32a(+)載體后轉(zhuǎn)入E. coli Rosetta(DE3)表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)與分析。結(jié)果表明,擴(kuò)增的截短E基因片段經(jīng)測(cè)序分析為1206 bp,與預(yù)期結(jié)果一致；重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)出大小約65 KDa的重組E蛋白；Western-blot分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白與抗DTMUV鴨血清有特異性反應(yīng),表明其具有免疫學(xué)活性。3.快速檢測(cè)DTMUV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條建立與應(yīng)用將膠體金溶液分別標(biāo)記重組E蛋白和羊抗鼠IgG,并以E蛋白作為檢測(cè)線,鼠IgG作為質(zhì)控線,制備可檢測(cè)DTMUV血清抗體的試紙條。通過試驗(yàn)條件的優(yōu)化,結(jié)果表明,膠體金顆粒與重組E蛋白、羊抗鼠IgG最適標(biāo)記pH分別約為6.8和6.7;1 mL膠體金溶液的最佳蛋白、羊抗鼠IgG標(biāo)記量分別為5.5μg和17.0μg。將試紙條分別檢測(cè)抗DTMUV、抗鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus, DuCV)、抗鴨甲肝病毒3型(Duck hepatitis virus type 3,DHAV-3)、抗鴨乙肝病毒(Duck hepatitis B virus, DHBV)、抗鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV)、抗鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)、抗大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)和抗腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis, SE)鴨血清,結(jié)果顯示僅檢測(cè)抗DTMUV鴨血清的試紙條為陽性。用試紙條檢測(cè)經(jīng)1:2’、1:22......1:210稀釋后的鴨抗DTMUV血清,結(jié)果顯示,該試紙條可檢測(cè)1:28稀釋的血清。采用該試紙條和文獻(xiàn)報(bào)道的ELISA方法同時(shí)檢測(cè)217份臨床鴨血清樣品,分析表明,兩種方法的檢測(cè)符合率達(dá)到97.24%。
【關(guān)鍵詞】：鴨坦布蘇病毒 E基因 克隆表達(dá) 血清抗體 膠體金免疫層析技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述及選題背景12-17
• 1 鴨坦布蘇病毒概述12-13
• 2 鴨坦布蘇病的檢測(cè)13-14
• 3 膠體金免疫層析技術(shù)14-16
• 3.1 GICA原理簡介14-15
• 3.2 GICA在動(dòng)物病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用15-16
• 4 選題意義16-17
• 第二部分 試驗(yàn)研究17-56
• 第一章 鴨坦布蘇病毒的純化、形態(tài)學(xué)觀察及其高免血清制備18-24
• 1 材料18-19
• 1.1 毒株與動(dòng)物18
• 1.2 主要儀器18
• 1.3 主要試劑18
• 1.4 溶液配制18-19
• 2 方法19-20
• 2.1 病毒增殖19
• 2.2 病毒純化19
• 2.2.1 病毒濃縮19
• 2.2.2 蔗糖密度梯度超速離心純化病毒19
• 2.3 病毒形態(tài)學(xué)觀察19-20
• 2.4 病毒含量測(cè)定20
• 2.5 鴨抗DTMUV免疫血清制備20
• 2.5.1 免疫抗原的制備20
• 2.5.2 免疫程序20
• 2.5.3 效價(jià)測(cè)定20
• 3 結(jié)果20-22
• 3.1 病毒純化20-21
• 3.2 病毒形態(tài)學(xué)觀察21
• 3.3 病毒含量測(cè)定21-22
• 3.4 抗體效價(jià)測(cè)定22
• 4 討論22-23
• 5 小結(jié)23-24
• 第二章 鴨坦布蘇病毒截短E基因的克隆表達(dá)24-36
• 1 材料24-26
• 1.1 毒株、菌株24
• 1.2 主要儀器24
• 1.3 主要試劑24-25
• 1.4 溶液配制25-26
• 1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳溶液25
• 1.4.2 SDS-PAGE電泳溶液25
• 1.4.3 Ni柱親和層析溶液25-26
• 1.4.4 免疫印跡溶液26
• 2 方法26-31
• 2.1 引物設(shè)計(jì)26
• 2.2 目的基因擴(kuò)增26-27
• 2.2.1 DTMUV總RNA提取26
• 2.2.2 cDNA的合成26
• 2.2.3 目的E基因的PCR擴(kuò)增26-27
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳27
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物回收純化27
• 2.3 目的E基因TA克隆27-28
• 2.3.1 連接反應(yīng)27
• 2.3.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備27
• 2.3.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化27
• 2.3.4 重組質(zhì)粒pGM-T-E抽提27
• 2.3.5 重組質(zhì)粒pGM-T-E酶切鑒定27-28
• 2.4 原核表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建28-29
• 2.4.1 雙酶切與膠回收28
• 2.4.2 連接反應(yīng)28
• 2.4.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化28
• 2.4.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E鑒定28-29
• 2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)29-30
• 2.5.1 重組質(zhì)粒pET-32a-E的轉(zhuǎn)化29
• 2.5.2 重組質(zhì)粒pET-32a-E的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 2.5.3 SDS-PAGE電泳29
• 2.5.4 表達(dá)條件優(yōu)化29-30
• 2.6 原核重組蛋白純化30
• 2.6.1 重組蛋白可溶性分析30
• 2.6.2 重組蛋白的純化30
• 2.6.3 重組蛋白復(fù)性和濃縮30
• 2.7 Western-blot分析30-31
• 3 結(jié)果31-34
• 3.1 截短E基因PCR擴(kuò)增31
• 3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建31-32
• 3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)32-33
• 3.3.1 pET-32a-E的誘導(dǎo)表達(dá)32
• 3.3.2 pET-32a-E表達(dá)條件優(yōu)化32-33
• 3.4 重組蛋白純化33-34
• 3.4.1 可溶性分析33
• 3.4.2 蛋白純化33-34
• 3.5 Western-blot分析34
• 4 討論34-35
• 5 小結(jié)35-36
• 第三章 檢測(cè)鴨坦布蘇病毒血清抗體的膠體金免疫層析試紙條的研制與應(yīng)用36-56
• 1 材料36-37
• 1.1 血清36
• 1.2 主要儀器36
• 1.3 主要試劑和材料36-37
• 1.4 主要溶液配制37
• 2 方法37-42
• 2.1 玻璃器皿處理37
• 2.2 膠體金溶液質(zhì)量鑒定37-38
• 2.2.1 肉眼觀察37
• 2.2.2 紫外掃描鑒定37-38
• 2.2.3 膠體金穩(wěn)定性鑒定38
• 2.3 金標(biāo)E蛋白制備38-39
• 2.3.1 重組E蛋白預(yù)處理38
• 2.3.2 膠體金溶液的準(zhǔn)備38
• 2.3.3 膠體金標(biāo)記重組E蛋白最適pH值選擇38-39
• 2.3.4 膠體金標(biāo)記E蛋白最適量的選擇39
• 2.4 金標(biāo)羊抗鼠IgG制備39
• 2.5 免疫膠體金鑒定和純化39-40
• 2.5.1 免疫膠體金鑒定39-40
• 2.5.2 免疫膠體金的純化40
• 2.6 膠體金試紙條初步組裝及鑒定40
• 2.7 試紙條反應(yīng)條件優(yōu)化40-41
• 2.7.1 試紙條組成材料選擇40-41
• 2.7.2 金標(biāo)復(fù)合物稀釋液和稀釋倍數(shù)選擇41
• 2.7.3 檢測(cè)線和質(zhì)控線包被濃度優(yōu)化41
• 2.8 免疫層析試紙條性能測(cè)定41-42
• 2.8.1 特異性試驗(yàn)41
• 2.8.2 敏感性試驗(yàn)41-42
• 2.8.3 重復(fù)性試驗(yàn)42
• 2.8.4 對(duì)比試驗(yàn)42
• 2.8.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)42
• 3 結(jié)果42-53
• 3.1 膠體金溶液質(zhì)量鑒定42-43
• 3.2 金標(biāo)E蛋白制備43-45
• 3.2.1 金標(biāo)E蛋白最適標(biāo)記pH選擇43-44
• 3.2.2 金標(biāo)E蛋白最適蛋白標(biāo)記量選擇44-45
• 3.3 金標(biāo)羊抗鼠IgG制備45-46
• 3.3.1 金標(biāo)羊抗鼠IgG最適標(biāo)記pH選擇45
• 3.3.2 金標(biāo)羊抗鼠IgG最適抗體標(biāo)記量選擇45-46
• 3.4 免疫膠體金的鑒定46
• 3.5 試紙條初步組裝及鑒定46-47
• 3.6 試紙條反應(yīng)條件的優(yōu)化47-51
• 3.6.1 層析膜的選擇47-48
• 3.6.2 金標(biāo)墊的選擇48-49
• 3.6.3 樣品墊的選擇49
• 3.6.4 吸收墊的選擇49
• 3.6.5 金標(biāo)復(fù)合物稀釋液和稀釋倍數(shù)的選擇49-50
• 3.6.6 檢測(cè)線和質(zhì)控線包被濃度優(yōu)化50-51
• 3.7 免疫層析試紙條的性能測(cè)定51-53
• 3.7.1 特異性試驗(yàn)51
• 3.7.2 敏感性試驗(yàn)51
• 3.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)51-52
• 3.7.4 對(duì)比試驗(yàn)52
• 3.7.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)52-53
• 4 討論53-54
• 5 小結(jié)54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-65
• 致謝65-66
• 個(gè)人簡歷及完成的學(xué)術(shù)論文目錄66

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2 葉寧;快速病理檢定儀研制報(bào)告[J];甘肅科技;2001年06期

3 龔云飛;陳宗倫;奚茜;李沐潔;王唯芬;王e，

本文編號(hào)：1016467