本文關鍵詞：檢測鴨坦布蘇病毒血清抗體的膠體金免疫層析試紙條研制

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【摘要】：本研究通過對CQWl株(GenBank登錄號：KM233707.1)鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)進行純化、形態(tài)結構觀察后,將純化病毒滅活、免疫健康雛麻鴨,獲得鴨抗DTMUV的免疫血清；以此病毒株的核酸為模板,RT-PCR擴增具有較強免疫原性的E基因,并采用原核表達系統(tǒng)對其進行體外表達：基于E基因表達的重組蛋白,首次建立了快速檢測DTMUV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條。研究的主要內(nèi)容歸結如下：1. DTMUV的純化、形態(tài)學觀察及其高免血清制備將CQW1分離株病毒接種9日齡的健康鴨胚,收集接種48 h后死亡鴨胚的尿囊液。采用蔗糖密度梯度(60%、45%和30%)離心純化DTMUV,透射電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)結構。結果顯示,在45%-60%蔗糖交界層,鏡下可見較多的純凈病毒粒子,大小約為50nm,具有核心、囊膜和突起結構。將純化的病毒經(jīng)甲醛滅活,制得免疫抗原后接種健康雛鴨,雙向瓊脂擴散試驗測定免疫鴨血清效價,獲得效價為1:32的鴨抗DTMUV血清,為后續(xù)實驗奠定了基礎。2. DTMUV截短E基因的克隆與表達將CQW1分離株的E基因序列進行生物信息學分析,截去其跨膜區(qū)并選取免疫原性較強的基因片段設計特異性引物,RT-PCR擴增截短E基因,將其克隆至pET-32a(+)載體后轉入E. coli Rosetta(DE3)表達菌進行誘導表達與分析。結果表明,擴增的截短E基因片段經(jīng)測序分析為1206 bp,與預期結果一致；重組菌經(jīng)IPTG誘導,成功表達出大小約65 KDa的重組E蛋白；Western-blot分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白與抗DTMUV鴨血清有特異性反應,表明其具有免疫學活性。3.快速檢測DTMUV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條建立與應用將膠體金溶液分別標記重組E蛋白和羊抗鼠IgG,并以E蛋白作為檢測線,鼠IgG作為質控線,制備可檢測DTMUV血清抗體的試紙條。通過試驗條件的優(yōu)化,結果表明,膠體金顆粒與重組E蛋白、羊抗鼠IgG最適標記pH分別約為6.8和6.7;1 mL膠體金溶液的最佳蛋白、羊抗鼠IgG標記量分別為5.5μg和17.0μg。將試紙條分別檢測抗DTMUV、抗鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus, DuCV)、抗鴨甲肝病毒3型(Duck hepatitis virus type 3,DHAV-3)、抗鴨乙肝病毒(Duck hepatitis B virus, DHBV)、抗鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV)、抗鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer, RA)、抗大腸桿菌(Escherichia coli, E. coli)和抗腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis, SE)鴨血清,結果顯示僅檢測抗DTMUV鴨血清的試紙條為陽性。用試紙條檢測經(jīng)1:2’、1:22......1:210稀釋后的鴨抗DTMUV血清,結果顯示,該試紙條可檢測1:28稀釋的血清。采用該試紙條和文獻報道的ELISA方法同時檢測217份臨床鴨血清樣品,分析表明,兩種方法的檢測符合率達到97.24%。
【關鍵詞】：鴨坦布蘇病毒 E基因 克隆表達 血清抗體 膠體金免疫層析技術
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 縮略詞表7-12
• 第一部分 文獻綜述及選題背景12-17
• 1 鴨坦布蘇病毒概述12-13
• 2 鴨坦布蘇病的檢測13-14
• 3 膠體金免疫層析技術14-16
• 3.1 GICA原理簡介14-15
• 3.2 GICA在動物病毒檢測方面的應用15-16
• 4 選題意義16-17
• 第二部分 試驗研究17-56
• 第一章 鴨坦布蘇病毒的純化、形態(tài)學觀察及其高免血清制備18-24
• 1 材料18-19
• 1.1 毒株與動物18
• 1.2 主要儀器18
• 1.3 主要試劑18
• 1.4 溶液配制18-19
• 2 方法19-20
• 2.1 病毒增殖19
• 2.2 病毒純化19
• 2.2.1 病毒濃縮19
• 2.2.2 蔗糖密度梯度超速離心純化病毒19
• 2.3 病毒形態(tài)學觀察19-20
• 2.4 病毒含量測定20
• 2.5 鴨抗DTMUV免疫血清制備20
• 2.5.1 免疫抗原的制備20
• 2.5.2 免疫程序20
• 2.5.3 效價測定20
• 3 結果20-22
• 3.1 病毒純化20-21
• 3.2 病毒形態(tài)學觀察21
• 3.3 病毒含量測定21-22
• 3.4 抗體效價測定22
• 4 討論22-23
• 5 小結23-24
• 第二章 鴨坦布蘇病毒截短E基因的克隆表達24-36
• 1 材料24-26
• 1.1 毒株、菌株24
• 1.2 主要儀器24
• 1.3 主要試劑24-25
• 1.4 溶液配制25-26
• 1.4.1 瓊脂糖凝膠電泳溶液25
• 1.4.2 SDS-PAGE電泳溶液25
• 1.4.3 Ni柱親和層析溶液25-26
• 1.4.4 免疫印跡溶液26
• 2 方法26-31
• 2.1 引物設計26
• 2.2 目的基因擴增26-27
• 2.2.1 DTMUV總RNA提取26
• 2.2.2 cDNA的合成26
• 2.2.3 目的E基因的PCR擴增26-27
• 2.2.4 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳27
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物回收純化27
• 2.3 目的E基因TA克隆27-28
• 2.3.1 連接反應27
• 2.3.2 大腸桿菌感受態(tài)細胞制備27
• 2.3.3 連接產(chǎn)物的轉化27
• 2.3.4 重組質粒pGM-T-E抽提27
• 2.3.5 重組質粒pGM-T-E酶切鑒定27-28
• 2.4 原核表達重組質粒構建28-29
• 2.4.1 雙酶切與膠回收28
• 2.4.2 連接反應28
• 2.4.3 連接產(chǎn)物的轉化28
• 2.4.4 重組表達質粒pET-32a-E鑒定28-29
• 2.5 重組表達質粒誘導表達29-30
• 2.5.1 重組質粒pET-32a-E的轉化29
• 2.5.2 重組質粒pET-32a-E的誘導表達29
• 2.5.3 SDS-PAGE電泳29
• 2.5.4 表達條件優(yōu)化29-30
• 2.6 原核重組蛋白純化30
• 2.6.1 重組蛋白可溶性分析30
• 2.6.2 重組蛋白的純化30
• 2.6.3 重組蛋白復性和濃縮30
• 2.7 Western-blot分析30-31
• 3 結果31-34
• 3.1 截短E基因PCR擴增31
• 3.2 重組表達質粒構建31-32
• 3.3 重組表達質粒誘導表達32-33
• 3.3.1 pET-32a-E的誘導表達32
• 3.3.2 pET-32a-E表達條件優(yōu)化32-33
• 3.4 重組蛋白純化33-34
• 3.4.1 可溶性分析33
• 3.4.2 蛋白純化33-34
• 3.5 Western-blot分析34
• 4 討論34-35
• 5 小結35-36
• 第三章 檢測鴨坦布蘇病毒血清抗體的膠體金免疫層析試紙條的研制與應用36-56
• 1 材料36-37
• 1.1 血清36
• 1.2 主要儀器36
• 1.3 主要試劑和材料36-37
• 1.4 主要溶液配制37
• 2 方法37-42
• 2.1 玻璃器皿處理37
• 2.2 膠體金溶液質量鑒定37-38
• 2.2.1 肉眼觀察37
• 2.2.2 紫外掃描鑒定37-38
• 2.2.3 膠體金穩(wěn)定性鑒定38
• 2.3 金標E蛋白制備38-39
• 2.3.1 重組E蛋白預處理38
• 2.3.2 膠體金溶液的準備38
• 2.3.3 膠體金標記重組E蛋白最適pH值選擇38-39
• 2.3.4 膠體金標記E蛋白最適量的選擇39
• 2.4 金標羊抗鼠IgG制備39
• 2.5 免疫膠體金鑒定和純化39-40
• 2.5.1 免疫膠體金鑒定39-40
• 2.5.2 免疫膠體金的純化40
• 2.6 膠體金試紙條初步組裝及鑒定40
• 2.7 試紙條反應條件優(yōu)化40-41
• 2.7.1 試紙條組成材料選擇40-41
• 2.7.2 金標復合物稀釋液和稀釋倍數(shù)選擇41
• 2.7.3 檢測線和質控線包被濃度優(yōu)化41
• 2.8 免疫層析試紙條性能測定41-42
• 2.8.1 特異性試驗41
• 2.8.2 敏感性試驗41-42
• 2.8.3 重復性試驗42
• 2.8.4 對比試驗42
• 2.8.5 穩(wěn)定性試驗42
• 3 結果42-53
• 3.1 膠體金溶液質量鑒定42-43
• 3.2 金標E蛋白制備43-45
• 3.2.1 金標E蛋白最適標記pH選擇43-44
• 3.2.2 金標E蛋白最適蛋白標記量選擇44-45
• 3.3 金標羊抗鼠IgG制備45-46
• 3.3.1 金標羊抗鼠IgG最適標記pH選擇45
• 3.3.2 金標羊抗鼠IgG最適抗體標記量選擇45-46
• 3.4 免疫膠體金的鑒定46
• 3.5 試紙條初步組裝及鑒定46-47
• 3.6 試紙條反應條件的優(yōu)化47-51
• 3.6.1 層析膜的選擇47-48
• 3.6.2 金標墊的選擇48-49
• 3.6.3 樣品墊的選擇49
• 3.6.4 吸收墊的選擇49
• 3.6.5 金標復合物稀釋液和稀釋倍數(shù)的選擇49-50
• 3.6.6 檢測線和質控線包被濃度優(yōu)化50-51
• 3.7 免疫層析試紙條的性能測定51-53
• 3.7.1 特異性試驗51
• 3.7.2 敏感性試驗51
• 3.7.3 重復性試驗51-52
• 3.7.4 對比試驗52
• 3.7.5 穩(wěn)定性試驗52-53
• 4 討論53-54
• 5 小結54-56
• 結論56-57
• 參考文獻57-65
• 致謝65-66
• 個人簡歷及完成的學術論文目錄66

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1 陳森;呂德堅;陸惠玲;;抗P30膠體金免疫試紙條靈敏度和特異性探討[J];中山大學研究生學刊(自然科學、醫(yī)學版);2005年02期

2 葉寧;快速病理檢定儀研制報告[J];甘肅科技;2001年06期

3 龔云飛;陳宗倫;奚茜;李沐潔;王唯芬;王e，

本文編號：1016467