本文關(guān)鍵詞：綿羊Prdx6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

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【摘要】：過(guò)氧化物氧還酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)廣泛存在于原核和真核生物的細(xì)胞質(zhì)中。其具有多種生物學(xué)功能,例如參與細(xì)胞增殖分化、保護(hù)自由基敏感蛋白、增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性、介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。主要功能是利用硫氧還原蛋白將過(guò)氧化物以及超氧化物進(jìn)行還原,消除代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化物。病原微生物侵入生物機(jī)體后,能夠被吞噬細(xì)胞吞噬并導(dǎo)致大量活性氧(ROS)的產(chǎn)生,達(dá)到殺滅病原微生物的目的。通過(guò)這個(gè)過(guò)程可以將大部分的病原微生物清除,但是仍然有某些細(xì)胞內(nèi)寄生菌可以逃避吞噬細(xì)胞的殺傷作用而存活在細(xì)胞內(nèi)。其中過(guò)氧化物氧化還原酶家族(Peroxiredoxins,Prdxs)對(duì)ROS的清除可能是胞內(nèi)寄生菌抵抗ROS氧化損傷作用,得以完成細(xì)胞內(nèi)寄生的重要免疫逃避機(jī)制之一。Prdx6是Prdxs家族中的一員,可有效使ROS失活,有可能被胞內(nèi)寄生菌利用達(dá)到清除胞內(nèi)活性氧完成胞內(nèi)寄生的目的。此外,近幾年研究還發(fā)現(xiàn)Prdx6除抗氧化作用外,還與糖尿病、癌癥發(fā)生發(fā)展、腦和肺疾病、以及多種細(xì)胞因子的分泌與免疫損傷有關(guān)。因此,Prdx6有可能成為某些疾病診斷的生物標(biāo)志分子。因此建立一種準(zhǔn)確、快速檢測(cè)組織細(xì)胞中Prdx6含量的檢測(cè)方法能夠?yàn)樵u(píng)估機(jī)體健康水平和抗氧化應(yīng)激能力提供有效工具。布魯氏菌病(Brucellosis,布病)是一種由布魯氏菌(Brucella)引起的嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的人獸共患傳染病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),綿羊白細(xì)胞層基因表達(dá)譜在布魯氏菌強(qiáng)毒株感染與疫苗接種兩種情況下發(fā)生變化。通過(guò)Real-time PCR證實(shí),與健康羊相比,自然感染強(qiáng)毒株綿羊白細(xì)胞中Prdx6上調(diào)表達(dá),而疫苗接種綿羊白細(xì)胞Prdx6基因的表達(dá)水平與強(qiáng)毒株感染存在差異。推測(cè)宿主Prdx6差異表達(dá)可能與布魯氏菌的胞內(nèi)寄生與增殖存在一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)綿羊Prdx6雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA),為進(jìn)一步研究Prdx6在機(jī)體疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的標(biāo)志作用,以及能否用于輔助區(qū)別診斷布病自然感染和疫苗免疫提供可應(yīng)用的檢測(cè)手段。實(shí)驗(yàn)所獲得綿羊Prdx6重組蛋白(r Oa Prdx6)純度較高,抗體效價(jià)較高、特異性好,能夠用于ELISA反應(yīng)。通過(guò)對(duì)ELISA反應(yīng)各條件優(yōu)化確定所建方法線性檢測(cè)范圍在8~500ng/m L,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.3349x-0.7978,相關(guān)系數(shù)R2=0.9946,回收率在94.84%~102.9%。最低檢測(cè)限為5.95 ng/m L。重復(fù)驗(yàn)證ELISA反應(yīng)結(jié)果一致,表明該雙抗體夾心ELISA方法的重復(fù)性較好。根據(jù)優(yōu)化后的ELISA檢測(cè)條件,組裝綿羊Prdx6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒。靈敏度高,檢測(cè)范圍在8 ng/m L~500 ng/m L;重復(fù)性好,試劑盒同一批次間和不同批次間所得檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。37℃破壞模擬實(shí)驗(yàn)證明試劑盒在4℃條件下保質(zhì)期一年以上。利用所建立的方法檢測(cè)臨床實(shí)際采集的綿羊抗凝血樣本白細(xì)胞中Prdx6含量,并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)部分羊白細(xì)胞Prdx6含量進(jìn)行ROC曲線分析,初步獲得布病疫苗免疫羊與未免疫羊Prdx6含量臨界值是31.9 ng/m L,該濃度下診斷敏感度為0.711,特異性為0.739,Youden指數(shù)最大為0.45。由于臨床實(shí)際樣本來(lái)源有限,布病患病、疫苗免疫與健康未免疫羊臨床樣品還需進(jìn)一步準(zhǔn)確采集,因此本研究所建立的綿羊Prdx6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法能否用于布病疫苗免疫與自然感染的輔助性區(qū)別鑒定還需進(jìn)一步研究。但是,本研究所建方法能夠檢測(cè)綿羊外周血白細(xì)胞中Prdx6的含量,具有較好的靈敏性和特異性,所組裝試劑盒靈敏性和重復(fù)性較好,貨架期一年,可用于相關(guān)的科學(xué)研究與應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：綿羊 Prdx6 ELISA 試劑盒 樣本檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 英文縮寫(xiě)詞表9-12
• 前言12-14
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述14-22
• 第一章 Prdx6研究進(jìn)展14-19
• 1 Prdxs蛋白家族14-16
• 2 Prdx6結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 3 Prdx6檢測(cè)意義17-18
• 4 Prdx6診斷方法概述18-19
• 第二章 布病流行現(xiàn)狀及診斷概述19-22
• 1 布魯氏菌病19
• 2 綿羊布魯氏菌病診斷方法研究進(jìn)展19-22
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究22-70
• 第三章 綿羊Prdx6重組蛋白和抗體的制備與分析22-36
• 1 材料與方法22-31
• 2 結(jié)果與分析31-34
• 3 討論34-35
• 4 小結(jié)35-36
• 第四章 綿羊Prdx6 ELISA檢測(cè)方法的建立36-46
• 1 材料與方法36-39
• 2 結(jié)果與分析39-43
• 3 討論43-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第五章 綿羊Prdx6雙抗體夾心ELISA檢測(cè)試劑盒的組裝46-56
• 1 材料與方法46-48
• 2 結(jié)果48-55
• 3 討論55
• 4 小結(jié)55-56
• 第六章 OaPrdx6 ELISA方法臨床血液樣本檢測(cè)與分析56-70
• 1 材料與方法56-59
• 2 結(jié)果59-67
• 3 討論67-69
• 4 小結(jié)69-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-76
• 作者簡(jiǎn)介76-77
• 致謝77

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