本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒疫苗的初步探索

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【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原,其主要感染6~18周齡的仔豬,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、黃疸和呼吸困難等癥狀。PCV2引起的相關(guān)疾病表現(xiàn)為世界流行,已經(jīng)給世界各國的養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了巨額經(jīng)濟(jì)損失,疫苗接種是控制該病毒在豬群中的爆發(fā)最有效的方法。目前市場上的PCV2商品化疫苗主要包括全病毒滅活苗和亞單位疫苗兩種,全病毒滅活苗方面,由于病毒自身的特點(diǎn)和生產(chǎn)工藝的問題,經(jīng)常出現(xiàn)病毒滴度難以提高等技術(shù)問題,有時(shí)需要濃縮才能達(dá)到要求。亞單位疫苗主要是使用桿狀病毒表達(dá)目的蛋白,免疫原性良好,但因其生產(chǎn)成本很高,難以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大規(guī)模使用。因此有必要研制高效實(shí)用、成本低廉的豬圓環(huán)疫苗,用以減少該病毒對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成的損失。本研究主要探索了可以形成病毒樣顆粒的PCV2全長Cap蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá),并將表達(dá)的目的蛋白制成病毒樣顆粒疫苗,以小鼠為模型評價(jià)該顆粒疫苗的免疫原性,主要研究內(nèi)容如下:1.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)以流行毒株P(guān)CV2b 119-GD01株編碼Cap的氨基酸序列作為基礎(chǔ)序列,進(jìn)行密碼子優(yōu)化和基因合成,得到目的基因r ORF2,并將r ORF2克隆到原核表達(dá)載體p ET-43.1a中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析顯示,誘導(dǎo)的融合蛋白約為100 KDa左右,并且主要以可溶形式存在,目的蛋白占上清總蛋白的50%以上;通過鎳柱親和層析和凝血酶的進(jìn)一步純化,得到了高純度的不含標(biāo)簽的Cap蛋白,并且重組蛋白和純化后的無標(biāo)簽?zāi)康牡鞍拙cPCV2 Cap蛋白單抗具有良好的反應(yīng)性。在電鏡下觀察純化后的Cap蛋白,可以看到大量直徑約為17 nm的病毒樣顆粒,該病毒樣顆粒與豬圓環(huán)病毒粒子的大小和結(jié)構(gòu)相似。2.病毒樣顆粒疫苗佐劑的篩選將表達(dá)的Cap蛋白分別與ISA201VG、ISA15VG、GEL01、鋁膠佐劑乳化或混合制成疫苗,免疫小鼠,每周檢測小鼠血清中針對Cap蛋白的特異性抗體水平。結(jié)果顯示,鋁膠佐劑組小鼠血清的特異性抗體在第二周即轉(zhuǎn)陽,并且該組的抗體水平在首免后4~7周均高于商品化亞單位疫苗組,即陽性對照組,但略低于ISA201VG佐劑組,綜合各佐劑的成本以及誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的時(shí)間、水平等因素,篩選鋁膠佐劑做為PCV2病毒樣顆粒疫苗的候選佐劑。3.病毒樣顆粒疫苗免疫次數(shù)的篩選以鋁膠作為佐劑制備病毒樣顆粒疫苗,分別采用免疫1次和免疫2次的免疫方式。免疫后血清中特異性抗體水平檢測結(jié)果顯示,免疫1次組和免疫2次組血清轉(zhuǎn)陽均發(fā)生在第二周,且早于陽性對照組;整體抗體水平免疫1次組稍低于免疫2次組,但差異不明顯,但二者均顯著高于商品化亞單位疫苗組。綜合血清轉(zhuǎn)陽時(shí)間以及抗體水平等因素,初步選擇該病毒樣顆粒疫苗的免疫次數(shù)為1次。4.病毒樣顆粒疫苗抗原免疫劑量的篩選試驗(yàn)組中每只小鼠按照20μg、40μg、60μg和80μg Cap蛋白的量進(jìn)行免疫,檢測免疫后各組特異性抗體產(chǎn)生情況。結(jié)果表明,血清中特異性抗體水平與免疫的抗原含量呈正相關(guān);當(dāng)免疫的抗原含量達(dá)到40μg每只小鼠時(shí),即可在免疫后第三周甚至是第二周在小鼠體內(nèi)檢測到較高的抗體水平。初步確定小鼠的免疫劑量為每只每次40μg Cap蛋白。本文將通過原核系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 Cap蛋白與鋁膠佐劑混合,制成了PCV2病毒樣顆粒疫苗。使用含有40μg Cap蛋白的該病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠,免疫后兩周可在血清中檢測到高水平的特異性抗體,證明該病毒樣顆粒疫苗具有很好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：豬圓環(huán)病毒2型 Cap蛋白 原核表達(dá) 病毒樣顆粒疫苗
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 英文縮略表8-12
• 1 前言12-27
• 1.1 病原學(xué)研究12-18
• 1.1.1 豬圓環(huán)病毒的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.1.2 PCV病原分類及其理化特性13
• 1.1.3 PCV2的基因組結(jié)構(gòu)和主要蛋白的生物學(xué)特性13-15
• 1.1.4 PCV2的致病機(jī)理15-16
• 1.1.5 PCV2的流行病學(xué)研究16-18
• 1.2 PCV2疫苗及其研究進(jìn)展18-26
• 1.2.1 全病毒滅活疫苗22-23
• 1.2.2 基因工程疫苗23-26
• 1.3 研究目的和意義26-27
• 2 材料和方法27-38
• 2.1 材料27-29
• 2.1.1 毒株、質(zhì)粒27
• 2.1.2 試驗(yàn)動物27
• 2.1.3 主要試劑27
• 2.1.4 常用試劑的配制27-29
• 2.1.5 主要儀器和設(shè)備29
• 2.2 方法29-38
• 2.2.1 目的基因的獲得29
• 2.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建29-33
• 2.2.3 重組表達(dá)菌的構(gòu)建33
• 2.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)33
• 2.2.5 重組蛋白的表達(dá)分析33
• 2.2.6 目的蛋白的純化33-34
• 2.2.7 目的蛋白的Western-blot分析34
• 2.2.8 Cap蛋白病毒樣顆粒形成的觀察34
• 2.2.9 病毒樣顆粒疫苗的制備34-36
• 2.2.10 病毒樣顆粒疫苗的小鼠免疫試驗(yàn)36-38
• 3 結(jié)果與分析38-43
• 3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果38
• 3.2 重組蛋白的表達(dá)38-39
• 3.3 目的蛋白的Western-blot分析39-40
• 3.4 病毒樣顆粒的觀察40
• 3.5 佐劑篩選試驗(yàn)40-41
• 3.6 免疫次數(shù)篩選41-42
• 3.7 免疫劑量篩選42-43
• 4 討論與結(jié)論43-46
• 全文總結(jié)46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 附錄55

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1013978