本文關(guān)鍵詞：鵝Ⅰ型和Ⅱ型干擾素免疫學(xué)特性及抗病毒功能研究

  更多相關(guān)文章： 鵝 干擾素及其受體 組織分布 免疫學(xué)特性 抗病毒功能

【摘要】：干擾素(IFN)是一類有效的抗病毒免疫蛋白,在外來病毒感染宿主的過程中,干擾素與其同源受體發(fā)生結(jié)合而活化特定的STAT分子從而啟動(dòng)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究對(duì)鵝Ⅰ型和Ⅱ型干擾素受體(IFNR)進(jìn)行了基因鑒定,探究了IFNα、 IFNy及其同源受體組織表達(dá)規(guī)律,并成功表達(dá)鵝IFNα、IFNy重組蛋白,從干擾素及相關(guān)免疫信號(hào)因子調(diào)控、病毒感染及抗原定位、干擾素抗病毒效應(yīng)等多方面解析了鵝干擾素免疫學(xué)活性和抗病毒功能。獲得結(jié)果如下：1.Ⅰ型與Ⅱ型干擾素受體的分子克隆本研究通過cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆了四川白鵝IFNAR1 (1616 bp)、 IFNAR2 (1525 bp)、IFNGR1 (1322 bp)、IFNGR2 (1438bp)基因的全序列,上傳至NCBI獲得Genbank序列號(hào)為IFNAR1(KM504097)、IFNAR2(KM504096)、IFNGR1(KM457284)、IFNGR2(KM461716)。經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)域分析及分子進(jìn)化樹分析表明禽類干擾素受體分子結(jié)構(gòu)相似,進(jìn)化關(guān)系接近。2.Ⅰ型與Ⅱ型干擾素及其受體的組織表達(dá)譜與免疫學(xué)特性研究采用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)1周齡雛鵝探究了IFN及其受體免疫基因的組織表達(dá)譜,分析發(fā)現(xiàn)IFNα、IFNy及其受體亞基在免疫相關(guān)組織中表達(dá)較高。在體外實(shí)驗(yàn)中,不同的免疫激動(dòng)劑均可上調(diào)鵝外周血淋巴細(xì)胞中干擾素基因的表達(dá)量,證明了鵝Ⅰ型與Ⅱ型干擾素對(duì)TLRs激動(dòng)劑的免疫特性。3.H9N2、TMUV、GPV病毒感染對(duì)干擾素表達(dá)的影響利用H9N2、GPV和TMUV人工感染雛鵝,通過免疫組化和熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)了不同器官的抗原信號(hào)和干擾素轉(zhuǎn)錄水平。H9N2禽流感病毒的抗原信號(hào)在脾臟、法氏囊、小腸、大腸、肺臟、氣管和肝臟中明顯。GPV感染組中,,在肝臟、肺臟、小腸、大腸、均有較強(qiáng)的GPV信號(hào)。TMUV感染組中,肝臟、腦、脾臟、小腸均檢測(cè)到較強(qiáng)的TMUV陽(yáng)性信號(hào)與CD8陽(yáng)性信號(hào)。在感染GPV或TMUV試驗(yàn)動(dòng)物中,IFNγ在免疫組織(脾臟、胸腺、哈德氏腺)和非免疫組織(小腸、肝臟、肺臟)的表達(dá)量均高于對(duì)照組,且鵝IFNγ與CD8和病原陽(yáng)性信號(hào)分布和強(qiáng)度相關(guān)聯(lián)。此外,H9N2、GPV或TMUV病毒孵育外周血淋巴細(xì)胞后,均能顯著上調(diào)IFNα與IFNγ的表達(dá)。4.1型與Ⅱ型干擾素蛋白的亞細(xì)胞定位研究以熒光質(zhì)粒作為骨架載體,重組質(zhì)粒pEGFP-IFNα和pEGFP-IFNγ成功構(gòu)建并在BHK21細(xì)胞中有效表達(dá),其大小分別約為46 kDa和44 kDa。IFNα蛋白主要以點(diǎn)狀、環(huán)狀、聚集狀,分布于細(xì)胞核周圍。IFNγ蛋白主要表現(xiàn)為點(diǎn)狀、團(tuán)狀、散在的星狀結(jié)構(gòu),廣泛分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。5.真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和重組蛋白的表達(dá)經(jīng)PCR和酶切鑒定,表明pcDNA3.1-IFNα與pcDNA3.1-IFNγ質(zhì)粒構(gòu)建成功。對(duì)體外培養(yǎng)BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,并經(jīng)免疫印跡驗(yàn)證確認(rèn)pcDNA3.1-IFNα與pcDNA3.1-IFNγ質(zhì)�？稍贐HK21細(xì)胞中成功表達(dá),重組鵝IFNα與IFNγ蛋白分別約為20 kDa和18 kDa,重組蛋白均在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后表達(dá)量較高。6.鵝Ⅰ型與Ⅱ型干擾素蛋白的抗病毒活性研究運(yùn)用免疫印跡、定量PCR和流式細(xì)胞儀分析技術(shù),對(duì)鴨瘟病毒的標(biāo)簽熒光蛋白、病毒拷貝數(shù)、病毒滴度進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)外源鵝Ⅰ型與Ⅱ型干擾素蛋白均可有效抑制鴨瘟病毒在DEF中的增殖和復(fù)制,證明了鵝Ⅰ型與Ⅱ型干擾素蛋白具有抗病毒功能。另外,鵝源干擾素可誘導(dǎo)鴨源細(xì)胞中干擾素及其抗病毒基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào),表明其在鴨源細(xì)胞中也具有生物學(xué)活性。本研究為進(jìn)一步研究重組鵝干擾素的抗病毒功能及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鵝 干擾素及其受體 組織分布 免疫學(xué)特性 抗病毒功能
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.33
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英語(yǔ)縮寫詞匯及其符號(hào)說明7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-18
• 1 IFN及其特異受體12-13
• 1.1 IFN12
• 1.2 IFNR12-13
• 2 IFN介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路13-14
• 2.1 JAK-STAT通路13-14
• 2.2 IRF調(diào)控因子14
• 2.3 正反饋調(diào)控機(jī)制14
• 3 IFN誘導(dǎo)的主要抗病毒蛋白14-16
• 3.1 PKR14-15
• 3.2 OAS15
• 3.3 Mx15
• 3.4 Viperin15-16
• 4 Ⅰ型和Ⅱ型IFN免疫活性及抗病毒活性16-17
• 5 研究目的和意義17-18
• 第二章 鵝IFNα和IFNγ受體的分子克隆18-26
• 1 材料18
• 1.1 菌株與質(zhì)粒18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑18
• 1.4 主要溶液及其配制18
• 1.5 主要儀器設(shè)備18
• 2 方法18-20
• 2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成18-20
• 2.2 保守區(qū)克隆20
• 2.3 序列末端克隆20
• 2.4 生物信息學(xué)分析20
• 3 結(jié)果20-25
• 3.1 保守序列擴(kuò)增電泳結(jié)果20-21
• 3.2 基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增電泳結(jié)果21
• 3.3 核酸與氨基酸序列分析21-23
• 3.4 結(jié)構(gòu)域分析23
• 3.5 系統(tǒng)進(jìn)化分析23-25
• 4 討論25-26
• 第三章 鵝IFN及其受體的組織表達(dá)譜與免疫特性研究26-32
• 1 材料26
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑26
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 1.3 主要儀器設(shè)備26
• 2 方法26-28
• 2.1 組織分離及研磨26
• 2.2 總RNA抽提26-27
• 2.3 反轉(zhuǎn)錄27
• 2.4 外周血淋巴細(xì)胞分離27
• 2.5 熒光定量PCR27-28
• 3 結(jié)果28-31
• 3.1 Ⅰ型與Ⅱ型干擾素及其受體組織表達(dá)譜28-29
• 3.2 Ⅰ型與Ⅱ型干擾素體外免疫特性29-31
• 4 討論31-32
• 第四章 不同病毒感染對(duì)鵝干擾素表達(dá)的影響32-44
• 1 材料32
• 1.1 實(shí)驗(yàn)毒株與動(dòng)物32
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑32
• 1.3 主要儀器32
• 2 方法32-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)32-33
• 2.2 組織樣本采集33
• 2.3 免疫組化染色33-34
• 3 結(jié)果34-41
• 3.1 H9N2病毒抗原定位與干擾素的表達(dá)34-37
• 3.2 TMUV與GPV病毒抗原定位與干擾素的表達(dá)37-41
• 4 討論41-44
• 4.1 H9N2感染對(duì)宿主抗病毒免疫反應(yīng)的影響41-42
• 4.2 TMUV與GPV感染對(duì)宿主抗病毒免疫反應(yīng)的影響42-44
• 第五章 鵝IFNα和IFNγ的亞細(xì)胞定位44-49
• 1 材料44
• 1.1 質(zhì)粒和試劑44
• 1.2 儀器和設(shè)備44
• 2 方法44-46
• 2.1 引物設(shè)計(jì)44
• 2.2 質(zhì)粒構(gòu)建44-45
• 2.3 質(zhì)粒抽取45
• 2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染45-46
• 2.5 爬片制作46
• 2.6 免疫印跡46
• 3 結(jié)果46-48
• 3.1 熒光質(zhì)粒的鑒定46-47
• 3.2 IFNα和IFNγ的亞細(xì)胞定位47
• 3.3 IFNα和IFNγ的免疫印跡47-48
• 4 討論48-49
• 第六章 鵝Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素的真核表達(dá)與鑒定49-53
• 1 材料49
• 1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞49
• 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑49
• 2 方法49-50
• 2.1 引物設(shè)計(jì)49
• 2.2 產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化49-50
• 2.3 重組質(zhì)粒鑒定50
• 2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染50
• 2.5 免疫印跡50
• 3 結(jié)果50-52
• 3.1 真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定50-51
• 3.3 蛋白的表達(dá)鑒定51-52
• 4 討論52-53
• 第七章 鵝Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素的抗病毒效應(yīng)研究53-65
• 1 材料53
• 1.1 鴨胚53
• 1.2 細(xì)胞與病毒53
• 1.3 主要試劑53
• 1.4 主要儀器53
• 2 方法53-55
• 2.1 GFP熒光強(qiáng)度觀察53
• 2.2 病毒基因拷貝數(shù)的檢測(cè)53-54
• 2.3 TCID_(50)的測(cè)定54
• 2.4 流式細(xì)胞儀的分析54
• 2.5 免疫印跡54
• 2.6 免疫基因的檢測(cè)54-55
• 3 結(jié)果55-63
• 3.1 病毒熒光強(qiáng)度觀察55-56
• 3.2 病毒拷貝數(shù)檢測(cè)56-58
• 3.3 病毒滴度檢測(cè)58
• 3.4 流式細(xì)胞儀分析58-59
• 3.5 免疫印跡分析59-60
• 3.6 抗病毒免疫小分子變化規(guī)律60-61
• 3.7 劑量依賴的鵝IFNα與IFNγ抗病毒效果61-63
• 4 討論63-65
• 小結(jié)65-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 致謝71

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本文編號(hào)：1013711