本文關鍵詞：廣西部分地區(qū)食源性溶血鏈球菌的分離鑒定及其CPS2J毒力基因的克隆及序列分析

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【摘要】：本文擬對廣西部分區(qū)域內食源性溶血鏈球菌的流行情況及其分子生物學特性等進行研究,為廣西食源性病原菌的流行病學和建立廣西畜禽產品食源性致病菌的菌種庫和基因信息庫提供科學依據。方法：(1)采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)、生化試驗、動物毒力試驗和PCR鑒定對2014年9月至2016年3月在廣西部分地區(qū)的農貿市場上采集到1257份生鮮肉樣品進行溶血鏈球菌的分離、鑒定,同時采用K-B紙片擴散法對溶血鏈球菌分離菌株進行藥敏試驗。(2)參考GenBank上已發(fā)表的鏈球菌CPS2J毒力基因序列設計合成引物,擴增長度為1152bp,采用PCR方法對60株溶血鏈球菌分離菌株進行CPS2J毒力基因擴增、克隆、序列測定,得出45株目的菌,并對其核苷酸序列進行同源性分析比較。結果：(1)通過常規(guī)細菌分離鑒定,從1257份生鮮肉樣品中分離得到溶血性鏈球菌60株,其中柳州市12株、桂林市27株、來賓市9株、上林市7株、南寧市5株。選取其中11株分離菌株接種小白鼠,8h至24h后動物死亡,結果表明分離到的11株溶血鏈球菌分離菌株對小白鼠均有較強的致病性。(2)藥敏試驗結果顯示,桂林市、來賓市、上林市、南寧市和柳州市分離菌株對阿莫西林的耐藥率分別達59%、33%、43%、40%和42%；桂林市和來賓市分離菌株對克林霉素的耐藥率分別達15%和11%；桂林市、來賓市、上林市、柳州市分離菌株對青霉素的耐藥率分別達41%、22%、29%、58%；桂林市、上林市、南寧市和柳州市分離菌株對萬古霉素的耐藥率分別達19%、29%、20%和17%；桂林市分離菌株對慶大霉素的耐藥率達11%。(3)60株溶血鏈球菌分離菌株中經PCR方法擴增出CPS2J毒力基因的有45株,將其與國內外標準菌株進行核苷酸序列同源性比較,結果顯示,與國內外標準菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8比較,來賓8株分離菌株(GLB-5、GLB-9、GLB-12、GLB-13、GLB-15、GLB-25、GLB-26、GLB-33)的CPS2J核苷酸同源性為84.4%-96.7%,柳州9株分離菌株(G17-1、G17-2-3、G17-3、GLZ-6、GLZ-8、G17-11、GLZ-14、GLZ-22、G17-23)的同源性為84.4%-96.7%,上林4株分離菌株(GSL-1、GSL-2、GSL-7、GSL-13)的同源性為84.2%-96.5%,桂林22株分離菌株(GGL-2、GGL-2-2、GGL-2-4、GGL-2-10、GGL-2-16、GGL-2-18、GGL-2-28、GGL-3-4、GGL-3-19、GGL-4、GGL-4-1、GGL-4-2、GGL-4-5、GGL-7、GGL-10、GGL-12、GGL-13、GGL-18、GGL-24、GGL-26、GGL-27、GGL-29)的同源性為79.8%-96.5%,南寧市2株分離菌株(GDST-2-2, GDST-5)的同源性為81.2%-90.5%；與國際標準菌株98015、SC17、SC22、5C152比較,來賓8株分離菌株同源性為83.7%-96.3%,柳州9株分離菌株的同源性為84.4%-96.7%,上林4株分離菌株同源性為84.2%-96.5%,桂林22株分離菌株同源性為79.8%-96.5%,南寧市2株分離菌株同源性為81.2%-90.5%；與國內標準菌株ZYS8比較,來賓6株分離菌株的同源性為84.8%-94.8%,柳州9株分離菌株的同源性為85.8%-95.4%,上林4株分離菌株同源性為85.6%-96.3%,桂林22株分離菌株同源性為84.2%-93.6%,南寧市2株分離菌株同源性為81.2%-90.5%；桂林22株分離菌株與上林4株分離菌株的CPS2J核苷酸比較,同源性為86.7%-99.9%,桂林22株分離菌株與柳州9株分離菌株的CPS2J核苷酸比較,同源性為77.8%-100%；國內外標準菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8,親緣關系較近。但廣西分離菌株GGL-2-4、GGL-20-1、GLZ-2相對獨立,與國內外菌株親緣關系相對較遠。ZYS8菌株與GLB-25菌株以及GGL-26菌株親緣關系較近,SC152菌株與GGL-27菌株親緣關系較近。結論：從廣西部分地區(qū)采集的1257份生鮮肉樣品中分離到的60株溶血鏈球菌分離菌株,部分具有明顯的耐藥性。60株中有45株含有CPS2J毒力基因,并對小鼠具有較強的致病性,這45株分離菌株CPS2J毒力基因的核苷酸與國內外標準毒株比較,其同源性存在一定差異,為建立廣西畜禽產品食源性致病菌風險評估及預警技術體系奠定理論基礎。
【關鍵詞】：溶血性鏈球菌 PCR CPS2J 毒力因子 檢測
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 縮略語表(Abbreviation)15-16
• 第一章 綜述16-32
• 1.1 豬鏈球菌的研究進展16-19
• 1.1.1 豬鏈球菌的病原學特征17
• 1.1.2 豬鏈球菌的流行病學研究17-19
• 1.2 豬鏈球菌抗原結構的分類19
• 1.3 豬鏈球菌的毒力因子19-24
• 1.3.1 莢膜多糖20-21
• 1.3.2 溶菌酶釋放蛋白及胞外因予21-22
• 1.3.3 溶血素22
• 1.3.4 粘附素22
• 1.3.5 谷氨酸脫氫酶22-23
• 1.3.6 纖維蛋白原結合蛋白23
• 1.3.7 毒力島23-24
• 1.3.8 其他毒力因子24
• 1.4 溶血性鏈球菌24-26
• 1.5 豬鏈球菌的檢測方法26-29
• 1.5.1 分離鑒定法26
• 1.5.2 血清學檢測方法26-27
• 1.5.3 分子生物學檢測方法27-29
• 1.6 臨床癥狀及病理變化29-30
• 1.6.1 急性敗血型29
• 1.6.2 腦膜炎型29
• 1.6.3 關節(jié)炎型29-30
• 1.7 豬鏈球菌的防治30
• 1.8 本研究的目的和意義30-31
• 1.9 本研究技術路線圖31-32
• 第二章 廣西部分區(qū)域食源性溶血鏈球菌的分離與鑒定32-42
• 2.1 材料32-34
• 2.1.1 樣品來源32
• 2.1.2 主要試劑32-33
• 2.1.3 培養(yǎng)基配制33
• 2.1.4 主要儀器33-34
• 2.2 方法34-36
• 2.2.1 樣品的處理34
• 2.2.2 分離培養(yǎng)34
• 2.2.3 涂片鏡檢34
• 2.2.4 生化特性34
• 2.2.5 PCR檢測34-36
• 2.3 結果36-39
• 2.3.1 細菌的形態(tài)特征36-37
• 2.3.2 生化鑒定37-38
• 2.3.3 PCR鑒定38-39
• 2.4 分析與討論39-41
• 2.5 本章小結41-42
• 第三章 溶血鏈球菌分離菌株的藥敏試驗42-52
• 3.1 材料42
• 3.1.1 菌液42
• 3.1.2 藥敏片42
• 3.1.3 血平板42
• 3.2 方法42-43
• 3.3 結果43-49
• 3.4 分析與討論49-50
• 3.5 本章小結50-52
• 第四章 溶血鏈球菌分離菌株的動物毒力試驗52-58
• 4.1 材料52-53
• 4.1.1 攻毒菌液的制備52
• 4.1.2 試驗動物52
• 4.1.3 試劑52
• 4.1.4 主要儀器52-53
• 4.2 方法53
• 4.3 結果53-56
• 4.4 分析與討論56-57
• 4.5 本章小結57-58
• 第五章 食源性溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的克隆及序列分析58-71
• 5.1 材料58-59
• 5.1.1 試驗菌株58
• 5.1.2 主要試劑及配制58
• 5.1.3 培養(yǎng)基58-59
• 5.2 方法59-62
• 5.2.1 溶血型鏈球菌CPS2J部分基因片段PCR檢測59-61
• 5.2.2 鏈球菌CPS2J部分基因片段序列測定61-62
• 5.3 結果62-68
• 5.3.1 溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的擴增結果62-63
• 5.3.2 溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的核苷酸同源性比較結果63-66
• 5.3.3 遺傳進化分析66-68
• 5.4 分析與討論68-70
• 5.5 本章小結70-71
• 第六章 全文結論71-72
• 參考文獻72-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況83

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本文編號：1008123