本文關(guān)鍵詞：廣西部分地區(qū)食源性溶血鏈球菌的分離鑒定及其CPS2J毒力基因的克隆及序列分析

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【摘要】：本文擬對(duì)廣西部分區(qū)域內(nèi)食源性溶血鏈球菌的流行情況及其分子生物學(xué)特性等進(jìn)行研究,為廣西食源性病原菌的流行病學(xué)和建立廣西畜禽產(chǎn)品食源性致病菌的菌種庫(kù)和基因信息庫(kù)提供科學(xué)依據(jù)。方法：(1)采用常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、動(dòng)物毒力試驗(yàn)和PCR鑒定對(duì)2014年9月至2016年3月在廣西部分地區(qū)的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上采集到1257份生鮮肉樣品進(jìn)行溶血鏈球菌的分離、鑒定,同時(shí)采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)溶血鏈球菌分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。(2)參考GenBank上已發(fā)表的鏈球菌CPS2J毒力基因序列設(shè)計(jì)合成引物,擴(kuò)增長(zhǎng)度為1152bp,采用PCR方法對(duì)60株溶血鏈球菌分離菌株進(jìn)行CPS2J毒力基因擴(kuò)增、克隆、序列測(cè)定,得出45株目的菌,并對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行同源性分析比較。結(jié)果：(1)通過(guò)常規(guī)細(xì)菌分離鑒定,從1257份生鮮肉樣品中分離得到溶血性鏈球菌60株,其中柳州市12株、桂林市27株、來(lái)賓市9株、上林市7株、南寧市5株。選取其中11株分離菌株接種小白鼠,8h至24h后動(dòng)物死亡,結(jié)果表明分離到的11株溶血鏈球菌分離菌株對(duì)小白鼠均有較強(qiáng)的致病性。(2)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,桂林市、來(lái)賓市、上林市、南寧市和柳州市分離菌株對(duì)阿莫西林的耐藥率分別達(dá)59%、33%、43%、40%和42%；桂林市和來(lái)賓市分離菌株對(duì)克林霉素的耐藥率分別達(dá)15%和11%；桂林市、來(lái)賓市、上林市、柳州市分離菌株對(duì)青霉素的耐藥率分別達(dá)41%、22%、29%、58%；桂林市、上林市、南寧市和柳州市分離菌株對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率分別達(dá)19%、29%、20%和17%；桂林市分離菌株對(duì)慶大霉素的耐藥率達(dá)11%。(3)60株溶血鏈球菌分離菌株中經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出CPS2J毒力基因的有45株,將其與國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行核苷酸序列同源性比較,結(jié)果顯示,與國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8比較,來(lái)賓8株分離菌株(GLB-5、GLB-9、GLB-12、GLB-13、GLB-15、GLB-25、GLB-26、GLB-33)的CPS2J核苷酸同源性為84.4%-96.7%,柳州9株分離菌株(G17-1、G17-2-3、G17-3、GLZ-6、GLZ-8、G17-11、GLZ-14、GLZ-22、G17-23)的同源性為84.4%-96.7%,上林4株分離菌株(GSL-1、GSL-2、GSL-7、GSL-13)的同源性為84.2%-96.5%,桂林22株分離菌株(GGL-2、GGL-2-2、GGL-2-4、GGL-2-10、GGL-2-16、GGL-2-18、GGL-2-28、GGL-3-4、GGL-3-19、GGL-4、GGL-4-1、GGL-4-2、GGL-4-5、GGL-7、GGL-10、GGL-12、GGL-13、GGL-18、GGL-24、GGL-26、GGL-27、GGL-29)的同源性為79.8%-96.5%,南寧市2株分離菌株(GDST-2-2, GDST-5)的同源性為81.2%-90.5%；與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株98015、SC17、SC22、5C152比較,來(lái)賓8株分離菌株同源性為83.7%-96.3%,柳州9株分離菌株的同源性為84.4%-96.7%,上林4株分離菌株同源性為84.2%-96.5%,桂林22株分離菌株同源性為79.8%-96.5%,南寧市2株分離菌株同源性為81.2%-90.5%；與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)菌株ZYS8比較,來(lái)賓6株分離菌株的同源性為84.8%-94.8%,柳州9株分離菌株的同源性為85.8%-95.4%,上林4株分離菌株同源性為85.6%-96.3%,桂林22株分離菌株同源性為84.2%-93.6%,南寧市2株分離菌株同源性為81.2%-90.5%；桂林22株分離菌株與上林4株分離菌株的CPS2J核苷酸比較,同源性為86.7%-99.9%,桂林22株分離菌株與柳州9株分離菌株的CPS2J核苷酸比較,同源性為77.8%-100%；國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)菌株98015、SC17、SC22、SC152和ZYS8,親緣關(guān)系較近。但廣西分離菌株GGL-2-4、GGL-20-1、GLZ-2相對(duì)獨(dú)立,與國(guó)內(nèi)外菌株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。ZYS8菌株與GLB-25菌株以及GGL-26菌株親緣關(guān)系較近,SC152菌株與GGL-27菌株親緣關(guān)系較近。結(jié)論：從廣西部分地區(qū)采集的1257份生鮮肉樣品中分離到的60株溶血鏈球菌分離菌株,部分具有明顯的耐藥性。60株中有45株含有CPS2J毒力基因,并對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性,這45株分離菌株CPS2J毒力基因的核苷酸與國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)毒株比較,其同源性存在一定差異,為建立廣西畜禽產(chǎn)品食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)警技術(shù)體系奠定理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：溶血性鏈球菌 PCR CPS2J 毒力因子 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-15
• 縮略語(yǔ)表(Abbreviation)15-16
• 第一章 綜述16-32
• 1.1 豬鏈球菌的研究進(jìn)展16-19
• 1.1.1 豬鏈球菌的病原學(xué)特征17
• 1.1.2 豬鏈球菌的流行病學(xué)研究17-19
• 1.2 豬鏈球菌抗原結(jié)構(gòu)的分類(lèi)19
• 1.3 豬鏈球菌的毒力因子19-24
• 1.3.1 莢膜多糖20-21
• 1.3.2 溶菌酶釋放蛋白及胞外因予21-22
• 1.3.3 溶血素22
• 1.3.4 粘附素22
• 1.3.5 谷氨酸脫氫酶22-23
• 1.3.6 纖維蛋白原結(jié)合蛋白23
• 1.3.7 毒力島23-24
• 1.3.8 其他毒力因子24
• 1.4 溶血性鏈球菌24-26
• 1.5 豬鏈球菌的檢測(cè)方法26-29
• 1.5.1 分離鑒定法26
• 1.5.2 血清學(xué)檢測(cè)方法26-27
• 1.5.3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法27-29
• 1.6 臨床癥狀及病理變化29-30
• 1.6.1 急性敗血型29
• 1.6.2 腦膜炎型29
• 1.6.3 關(guān)節(jié)炎型29-30
• 1.7 豬鏈球菌的防治30
• 1.8 本研究的目的和意義30-31
• 1.9 本研究技術(shù)路線(xiàn)圖31-32
• 第二章 廣西部分區(qū)域食源性溶血鏈球菌的分離與鑒定32-42
• 2.1 材料32-34
• 2.1.1 樣品來(lái)源32
• 2.1.2 主要試劑32-33
• 2.1.3 培養(yǎng)基配制33
• 2.1.4 主要儀器33-34
• 2.2 方法34-36
• 2.2.1 樣品的處理34
• 2.2.2 分離培養(yǎng)34
• 2.2.3 涂片鏡檢34
• 2.2.4 生化特性34
• 2.2.5 PCR檢測(cè)34-36
• 2.3 結(jié)果36-39
• 2.3.1 細(xì)菌的形態(tài)特征36-37
• 2.3.2 生化鑒定37-38
• 2.3.3 PCR鑒定38-39
• 2.4 分析與討論39-41
• 2.5 本章小結(jié)41-42
• 第三章 溶血鏈球菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)42-52
• 3.1 材料42
• 3.1.1 菌液42
• 3.1.2 藥敏片42
• 3.1.3 血平板42
• 3.2 方法42-43
• 3.3 結(jié)果43-49
• 3.4 分析與討論49-50
• 3.5 本章小結(jié)50-52
• 第四章 溶血鏈球菌分離菌株的動(dòng)物毒力試驗(yàn)52-58
• 4.1 材料52-53
• 4.1.1 攻毒菌液的制備52
• 4.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物52
• 4.1.3 試劑52
• 4.1.4 主要儀器52-53
• 4.2 方法53
• 4.3 結(jié)果53-56
• 4.4 分析與討論56-57
• 4.5 本章小結(jié)57-58
• 第五章 食源性溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的克隆及序列分析58-71
• 5.1 材料58-59
• 5.1.1 試驗(yàn)菌株58
• 5.1.2 主要試劑及配制58
• 5.1.3 培養(yǎng)基58-59
• 5.2 方法59-62
• 5.2.1 溶血型鏈球菌CPS2J部分基因片段PCR檢測(cè)59-61
• 5.2.2 鏈球菌CPS2J部分基因片段序列測(cè)定61-62
• 5.3 結(jié)果62-68
• 5.3.1 溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的擴(kuò)增結(jié)果62-63
• 5.3.2 溶血鏈球菌CPS2J毒力基因的核苷酸同源性比較結(jié)果63-66
• 5.3.3 遺傳進(jìn)化分析66-68
• 5.4 分析與討論68-70
• 5.5 本章小結(jié)70-71
• 第六章 全文結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-82
• 致謝82-83
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文情況83

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本文編號(hào)：1008123