本文關(guān)鍵詞：鼠源單克隆抗體犬源化的研究

  更多相關(guān)文章： 犬細(xì)小病毒 雙抗體夾心ELISA 重疊延伸PCR 犬-鼠嵌合抗體 真核表達(dá)

【摘要】：犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬的成員,病毒粒子無囊膜,核衣殼為等軸對(duì)稱的二十面體,對(duì)外界抵抗力強(qiáng),CPV只有CPV-2一個(gè)抗原型,該病傳染性強(qiáng),發(fā)病迅猛,病情嚴(yán)重,死亡率高,犬之間通過直接或間接接觸而傳播該病?發(fā)病犬有兩種表現(xiàn)型:心肌炎型與腸炎型?腸炎型以嚴(yán)重的嘔吐與嚴(yán)重的出血性腹瀉為主;心肌炎型以幼犬呼吸與心血管的衰竭為主要特征?犬細(xì)小病毒病治療尚無特效藥物,臨床治療時(shí)采用對(duì)癥治療?支持療法和特異性療法結(jié)合應(yīng)用?其中特異性療法主要采用注射高免血清和單克隆抗體進(jìn)行治療,在CPV感染早期,單克隆抗體治療效果顯著,然而鼠源單克隆抗體的異源性在臨床治療引起宿主免疫反應(yīng),使單抗療效降低,甚至誘發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)?因此有必要對(duì)其進(jìn)行改造,為此本研究首先建立了檢測(cè)犬免疫球蛋白G(IgG)的雙夾心ELISA方法,而后構(gòu)建嵌合抗體全長(zhǎng)基因質(zhì)粒并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá),為后期建立穩(wěn)定表達(dá)犬-鼠嵌合抗體細(xì)胞系奠定基礎(chǔ),為以后開發(fā)犬細(xì)小病毒病抗體藥物治療提供支持。本研究以兔抗犬IgG Fc段多克隆抗體為包被抗體,過氧化酶標(biāo)記的兔抗犬IgG(全分子)多克隆抗體為檢測(cè)抗體,建立了雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法,并采用Protein A方法從犬血清中純化犬IgG作為ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品?該檢測(cè)方法與小鼠?兔?馬?牛?雞及羊常見動(dòng)物血清無交叉反應(yīng),特異性好;最低檢測(cè)下限可以達(dá)到4.8 ng/m L,敏感性較高?目的在于提供一種檢測(cè)犬IgG的檢測(cè)方法以及便于后期檢測(cè)犬-鼠嵌合抗體的表達(dá)和篩選穩(wěn)定表達(dá)犬-鼠嵌合抗體的細(xì)胞系?本研究成功從雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增了抗體重鏈輕鏈可變區(qū),經(jīng)IMGT網(wǎng)站分析所擴(kuò)增的序列具有抗體功能,從犬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中擴(kuò)增了犬IgG重鏈輕鏈恒定區(qū),經(jīng)NCBI進(jìn)行Blast分析與犬IgG重鏈輕鏈基因同源性均在99%以上,并通過重疊延伸PCR成功拼接為嵌合序列,定向克隆至pcDNA3.1(+)載體上,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,經(jīng)ELISA檢測(cè)成功表達(dá),并純化了嵌合抗體,本研究為犬-鼠嵌合重組抗體表達(dá)方法的建立提供了實(shí)驗(yàn)支持,也為今后下一步鑒定抗體效力和功能以及建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：犬細(xì)小病毒 雙抗體夾心ELISA 重疊延伸PCR 犬-鼠嵌合抗體 真核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.292
【目錄】：

• 中文摘要6-7
• Summary7-9
• 縮略詞9-10
• 第一章 前言10-20
• 1.1 犬細(xì)小病毒的研究進(jìn)展10-14
• 1.1.1 病原學(xué)10-11
• 1.1.2 流行病學(xué)11
• 1.1.3 臨床癥狀11-12
• 1.1.4 病理變化12
• 1.1.5 診斷12-13
• 1.1.6 防治13-14
• 1.2 單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展14-17
• 1.2.1 鼠源單克隆抗體14-15
• 1.2.2 人源化嵌合抗體15
• 1.2.3 人源化改型抗體15-16
• 1.2.4 全人源抗體16-17
• 1.2.5 抗體藥物的未來展望17
• 1.3 重組抗體技術(shù)的研究進(jìn)展17-19
• 1.4 本研究的目的與意義19-20
• 第二章 檢測(cè)犬免疫球蛋白G的夾心ELISA方法的建立20-34
• 2.1 材料與設(shè)備20-22
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑20-22
• 2.1.2 主要設(shè)備和儀器22
• 2.2 方法22-25
• 2.2.1 犬血清中IgG的獲得和濃度測(cè)定22-23
• 2.2.2 犬IgG純度鑒定23
• 2.2.3 ELISA方法建立23-24
• 2.2.4 特異性試驗(yàn)24-25
• 2.2.5 敏感性試驗(yàn)25
• 2.2.6 犬細(xì)小陽(yáng)性血清和陰性血清IgG含量比較25
• 2.3 結(jié)果25-32
• 2.3.1 純化IgG濃度測(cè)定25-26
• 2.3.2 純化IgG純度測(cè)定26-27
• 2.3.3 ELISA方法最優(yōu)條件的確立27-30
• 2.3.4 特異性試驗(yàn)30-31
• 2.3.5 敏感性試驗(yàn)31-32
• 2.3.6 細(xì)小陽(yáng)性血清和陰性血清IgG含量比較32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 嵌合抗體重鏈?輕鏈全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-53
• 3.1 材料與設(shè)備34-35
• 3.1.1 細(xì)胞?質(zhì)粒及主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備34-35
• 3.2 方法35-47
• 3.2.1 鼠源單克隆抗體輕鏈?重鏈可變區(qū)的擴(kuò)增35-39
• 3.2.2 犬源抗體輕鏈?重鏈恒定區(qū)的擴(kuò)增39-40
• 3.2.3 犬-鼠嵌合抗體輕鏈?重鏈全長(zhǎng)序列的擴(kuò)增40-46
• 3.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建46
• 3.2.5 重組質(zhì)粒的小量提取46
• 3.2.6 重組質(zhì)粒的鑒定46-47
• 3.3 結(jié)果47-51
• 3.3.1 雜交瘤細(xì)胞基因可變區(qū)的擴(kuò)增47
• 3.3.2 雜交瘤細(xì)胞基因可變區(qū)的序列分析47-48
• 3.3.3 犬IgG抗體恒定區(qū)基因的擴(kuò)增48-49
• 3.3.4 犬-鼠嵌合抗體重鏈?輕鏈全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增49-50
• 3.3.5 重組質(zhì)粒的酶切鑒定50-51
• 3.4 討論51-53
• 第四章 嵌合抗體的表達(dá)與純化53-65
• 4.1 材料53-55
• 4.1.1 細(xì)胞?質(zhì)粒和主要試劑53
• 4.1.2 細(xì)胞表達(dá)所用試劑53
• 4.1.3 ELISA所用試劑53-54
• 4.1.4 嵌合抗體純化所用試劑54
• 4.1.5 主要儀器54-55
• 4.2 方法55-60
• 4.2.1 重組質(zhì)粒的的大量提取55-56
• 4.2.2 CHO細(xì)胞的復(fù)蘇56
• 4.2.3 CHO細(xì)胞的培養(yǎng)56
• 4.2.4 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染56-57
• 4.2.5 ELISA檢測(cè)57-58
• 4.2.6 犬-鼠嵌合抗體純化58
• 4.2.7 犬-鼠嵌合抗體純化的鑒定58-60
• 4.3 結(jié)果60-63
• 4.3.1 ELISA檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)60-61
• 4.3.2 嵌合抗體的純化結(jié)果61-63
• 4.4 討論63-65
• 第五章 全文結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-69
• 致謝69-70
• 附錄Ⅰ70-71

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