本文關(guān)鍵詞：Purα基因過(guò)表達(dá)和RNAi慢病毒載體的構(gòu)建及應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： Purα 慢病毒表達(dá)載體 RNA沉寂 基因過(guò)表達(dá) 基因操作

【摘要】：目的構(gòu)建Purα基因過(guò)表達(dá)以及SiRNA慢病毒表達(dá)載體,通過(guò)包裝病毒,以用于神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞感染及原代培養(yǎng)神經(jīng)元的基因操作。方法 1)過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建:本實(shí)驗(yàn)使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒載體,PCR擴(kuò)增Purα全長(zhǎng)基因,然后亞克隆到pCDH載體相應(yīng)的多克隆位點(diǎn)之中,進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定;2)ShRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)shRNA的特征,設(shè)計(jì)shRNA的DNA序列以及其反向互補(bǔ)序列,然后合成并克隆到慢病毒載體pLKO.1-puro的相應(yīng)位點(diǎn)中。3)慢病毒包裝和滴度測(cè)定:將克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA載體和病毒包裝質(zhì)粒pCMV-VSVG、pCMV-dR8.2 dvpr按相應(yīng)的比例轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中,48h后收集上清液,純化、濃縮,進(jìn)行滴度測(cè)定。結(jié)果測(cè)序結(jié)果證實(shí)所插入片段相位正確,轉(zhuǎn)染后通過(guò)RT-PCR和Western blot證實(shí)過(guò)表達(dá)組Purα基因表達(dá)增高,而沉寂組的Purα表達(dá)抑制,達(dá)到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求,可以用于實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)論利用本方法可以快速地進(jìn)行目的基因的基因操作,省時(shí)、節(jié)約,與同類型的方法比較,具有較大的優(yōu)越性,可以在實(shí)驗(yàn)中推廣應(yīng)用。
【作者單位】： 寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏顱腦疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： Purα 慢病毒表達(dá)載體 RNA沉寂 基因過(guò)表達(dá) 基因操作
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81260197) 973基金(2012CB722408)
【分類號(hào)】：R346
【正文快照】： 在基因分析過(guò)程中對(duì)目的基因進(jìn)行敲除是一種行之有效的方法,但是在實(shí)際操作過(guò)程中存在著周期長(zhǎng)、費(fèi)用高的問(wèn)題,而且有些目的基因的系統(tǒng)性敲除會(huì)造成子代動(dòng)物死亡于胚胎期或在出生后即死亡的問(wèn)題,并不能達(dá)到基因分析的目的[1]。RNAi技術(shù)的出現(xiàn)為解決這一難題提供了有效的途徑,

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

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【相似文獻(xiàn)】

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6 記者 師巧梅;我區(qū)綿羊轉(zhuǎn)基因研究取得重大突破[N];新疆日?qǐng)?bào)(漢);2010年

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本文編號(hào)：996629