發(fā)布時間：2017-10-07 23:33

  本文關鍵詞：Prx Ⅲ在大鼠腎缺血再灌注損傷模型心肌內(nèi)的表達變化

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【摘要】：腎臟是機體內(nèi)重要的排泄與分泌器官,對維持機體酸堿平衡以及鉀、鈉、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定具有重要作用。因此,腎臟對維持機體整個內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn):當腎臟功能被損害時,其遠端或鄰近器官如肝、肺、心、腦和腸等的功能也會同時受損[1]。腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是臨床上一種常見的病理生理反應,常見于腎臟移植或急性腎動脈阻斷等臨床治療過程中。RIRI也是導致腎移植病人術后功能恢復延遲,甚至發(fā)生急性腎衰增加患者死亡率的重要因素。在到達腎臟的血流被暫時性阻斷,隨后又恢復其血液供應重新充氧的過程中,會有大量的活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,導致腎臟處于高度氧化應激狀態(tài)。這也是引發(fā)缺血再灌注損傷的重要機制之一。ROS的成員主要包括超氧陰離子(O~(2-))、羥自由基(OH-)和過氧化氫(H_2O_2)等。ROS的化學性質(zhì)非�；顫�,可以與細胞內(nèi)的功能蛋白質(zhì)、DNA和胞膜上的脂類等生物大分子發(fā)生過氧化反應,促進細胞凋亡和死亡,加劇腎臟組織損傷。Peroxiredoxin(Prx)是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類能清除ROS的過氧化物酶系。Prx Ⅲ是Prx家族成員之一,也是整個家族中唯一的特異性定位于線粒體的酶蛋白。研究發(fā)現(xiàn):Prx Ⅲ產(chǎn)生于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng),然后依靠定位信號定位于線粒體。線粒體是細胞內(nèi)ROS的主要產(chǎn)生來源,同時它自身也是ROS的主要攻擊靶點。近些年的研究發(fā)現(xiàn):Prx Ⅲ與細胞線粒體內(nèi)H_2O_2的清除有密切關系。Prx Ⅲ可能是線粒體內(nèi)ROS的重要清除者。心臟是機體內(nèi)需氧量大、對缺血缺氧反應極為敏感的臟器之一。線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP是心肌細胞的主要能量來源。在此過程中會有大量電子從呼吸鏈泄露出來從而形成ROS。因此,心臟是機體內(nèi)最容易受到ROS攻擊遭受過氧化損傷的器官。在腎缺血再灌注損傷發(fā)生后,腎臟處于高度氧化應激狀態(tài)時,心臟此時是否也會發(fā)生過氧化損傷,氧化應激是否也是引起心肌損傷的主要機制之一?心肌組織Prx Ⅲ的表達如何變化,是否參與此氧化應激過程?未見報道。本研究采用無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型。再灌注24小時后觀察心肌組織內(nèi)H_2O_2含量、MDA含量,以及抗氧化酶Prx Ⅲ基因水平和蛋白水平的表達變化,探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌組織損傷的氧化應激機制,以及Prx Ⅲ在缺血再灌注損傷過程中的抗氧化作用,為防治腎缺血再灌注引起的心肌組織損傷提供一條新思路。目的:觀察大鼠腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌組織是否也處于氧化應激狀態(tài),以及抗氧化酶Prx Ⅲ的基因水平和蛋白水平的表達變化,探討腎臟缺血再灌注損傷誘發(fā)心肌損傷的氧化應激機制,以及Prx Ⅲ在此過程中可能發(fā)揮的抗氧化作用。方法:1腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材雄性Wister大鼠12只,體重200±10g,購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心,隨機分為對照組(Control)和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI),每組各6只。用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg),參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI組大鼠開腹后暴露其雙側(cè)腎臟,先切除右腎,然后鈍性分離左腎動脈,在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈,觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動脈夾,恢復血液供應,肉眼可見腎動脈充盈,腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色,表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎,分離左腎動脈,但不夾閉左腎動脈。24小時后收集血液,3000rpm離心10min,分離血清用于肌酐(Serum Creatinine,SCr)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)濃度測定;處死大鼠取腎臟和心臟,將腎臟于4%多聚甲醛中固定進行HE染色,觀察腎臟的形態(tài)學改變。將心臟置于液氮中用于Prx Ⅲ m RNA和蛋白水平測定以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和H_2O_2含量測定。2測定指標及方法2.1血清SCr和BUN水平測定血清SCr濃度采用苦味酸法測定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。2.2 HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)腎臟組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明,石蠟包埋后,切片厚約5μm,蘇木精伊紅染色,日本產(chǎn)Olympus光學顯微鏡下觀察腎臟的形態(tài)變化并進行圖象分析。2.3大鼠心肌組織MDA含量測定將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%心肌組織勻漿,勻漿內(nèi)MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。2.4大鼠心肌組織H_2O_2含量測定將從-70℃冰箱中取出的心肌組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH7.4,1mmol/L鹽酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇),冰浴中勻漿,勻漿液4000rpm 4℃離心20min,取上清即制成10%心肌組織勻漿。勻漿內(nèi)H_2O_2含量采用鉬酸比色法測定,以每克樣本蛋白所含的過氧化氫的量(mmol/g pro)表示。2.5大鼠心肌組織Prx Ⅲ m RNA水平測定用TRIzol法提取心肌總RNA。約3μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成c DNA。以GAPDH為內(nèi)對照,進行RT-PCR。分別以Prx Ⅲ的擴增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的相對表達量2.6大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平測定采用Western blot法測定大鼠心肌組織內(nèi)抗氧化酶Prx Ⅲ的蛋白表達水平。將大鼠心肌組織制成勻漿,離心后取上清。采用改良Lowry法測定其蛋白總量.電泳的蛋白上樣量為62 ug.經(jīng)過轉(zhuǎn)膜及封閉處理后,在PVDF膜上加入兔抗Prx Ⅲ抗體,室溫靜置過夜。經(jīng)洗膜后再加入熒光標記的抗兔Ig G二抗。經(jīng)雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進行圖像數(shù)值分析。結(jié)果:1大鼠腎組織的形態(tài)學改變光學顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠曲小管及集合管形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見部分腎小球萎縮,體積變小;腎小囊腔擴張;腎小管管腔明顯擴張;腎間質(zhì)水腫,腎小管間隙擴大;集合管出現(xiàn)管腔擴張等改變。2血清SCr水平Con組大鼠血清中SCr的濃度為103.444±8.465μmol/L,而RIRI組血清SCr的濃度為131.153±17.814μmol/L。RIRI組大鼠血清SCr濃度明顯高于Con組(P0.05)。3血清BUN水平Con組大鼠血清BUN的濃度為4.462±0.541 mmol/L,而RIRI組血清BUN的濃度為13.685±4.397 mmol/L。RIRI組大鼠血清BUN的濃度明顯高于Con組(P0.05)。4心肌組織勻漿內(nèi)MDA的含量Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量為10.18±1.77mmol/g,而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量為14.01±2.29 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的MDA含量明顯高于Con組(P0.01)。5大鼠心肌組織勻漿內(nèi)H_2O_2的含量Con組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為13.93±1.88 mmol/g,而RIRI組心肌組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量為18.56±2.56 mmol/g。RIRI組大鼠心肌組織勻漿內(nèi)的H_2O_2含量明顯高于Con組(P0.01)。6大鼠心肌組織Prx Ⅲ m RNA的相對表達量采用RT-PCR的方法測定大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ m RNA的相對表達量。Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ m RNA的相對表達量為0.95±0.17,RIRI組心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ m RNA的相對表達量為1.34±0.18,RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ m RNA水平明顯高于Con組(P0.01)。說明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的基因表達水平升高。7大鼠心肌組織Prx Ⅲ蛋白水平Con組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平為0.58±0.09,RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平為1.01±0.17。RIRI組Prx Ⅲ蛋白水平明顯高于對照組(P0.01)。說明RIRI組大鼠心肌組織內(nèi)Prx Ⅲ的蛋白表達水平升高。結(jié)論:1切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。2腎臟缺血再灌注損傷發(fā)生后,心肌組織也處于高度氧化應激狀態(tài),并引起心肌組織的過氧化損傷。3 Prx Ⅲ的基因和蛋白表達水平在RIRI模型心肌組織內(nèi)均明顯增強。表明Prx Ⅲ可能參與了RIRI所誘發(fā)的心肌組織氧化應激反應,在心肌組織內(nèi)發(fā)揮了抗氧化作用。
【關鍵詞】：腎缺血再灌注損傷 氧化應激 Prx Ⅲ MDA H_2O_2
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R692;R-332
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-15
• 前言15-17
• 材料與方法17-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-34
• 附表34-36
• 討論36-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-41
• 綜述 腎缺血再灌注損傷的病理生理學表達變化41-54
• 參考文獻48-54
• 致謝54-55
• 個人簡歷55

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本文編號：990751