本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)3-羥基丙酸肺炎克雷伯氏菌基因表達(dá)調(diào)控元件的研究

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【摘要】：3-羥基丙酸(3-HP)作為重要的平臺(tái)化合物,有著廣闊的市場(chǎng)前景。Klebsiella pneumoniae因其較高的甘油耐受性、較強(qiáng)的甘油代謝能力、發(fā)酵周期短等特點(diǎn)成為利用甘油生物法生產(chǎn)3-HP的優(yōu)勢(shì)宿主菌。但由于可用啟動(dòng)子相對(duì)較少,且少數(shù)已知可用的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)較弱,造成3-HP的生產(chǎn)過程轉(zhuǎn)化率較低。本研究針對(duì)這一問題進(jìn)行探索,通過構(gòu)建K. pneumoniae高效表達(dá)系統(tǒng),對(duì)K. pneumoniae甘油代謝途徑進(jìn)行改造,實(shí)現(xiàn)3-HP的高產(chǎn)。1、選擇K. pneumoniae中13個(gè)生長(zhǎng)代謝必需基因的啟動(dòng)子構(gòu)建組成型啟動(dòng)子庫(kù),利用GFP報(bào)告系統(tǒng)對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行篩選,獲得了具有較高轉(zhuǎn)錄活性的組成型啟動(dòng)子Pkan,該表達(dá)系統(tǒng)無需加入誘導(dǎo)劑即可實(shí)現(xiàn)相對(duì)恒定的高效表達(dá),其轉(zhuǎn)錄活性約為K. pneumoniae常用表達(dá)系統(tǒng)pET-pk的1.7倍,且對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝影響較小,可用于構(gòu)建K. pneumoniae高效組成型表達(dá)系統(tǒng)。2、為提高3-HP產(chǎn)量,利用Pkan過表達(dá)來自Escherichia coli醛脫氫酶基因aldH,構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)甘油到.3-HP的高效轉(zhuǎn)化。重組菌的搖瓶發(fā)酵數(shù)據(jù)表明,3-HP產(chǎn)量為0.47g/L,與野生菌相比提高了89.5%,與具有相同代謝負(fù)荷的空質(zhì)粒對(duì)照菌相比增加了238%。上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn),目的產(chǎn)物的產(chǎn)量為15.28g/L,甘油轉(zhuǎn)化率達(dá)13.02%,時(shí)空產(chǎn)率為0.57 g·L-·h-1。3、為提高啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,對(duì)tac啟動(dòng)子核心序列進(jìn)行串聯(lián)獲得復(fù)合啟動(dòng)子。利用此表達(dá)系統(tǒng)過表達(dá)醛脫氫酶基因puuC,構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)3-HP的高產(chǎn)。重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明重組菌K.p(pETP3core-tac-puuC)、K. p(pETP5core-tac-puuC)的3-HP產(chǎn)量分別為2.88g/L、3.10g/L。上罐發(fā)酵結(jié)果表明,3-HP的終產(chǎn)量分別為99.8 g/L81.4g/L；甘油轉(zhuǎn)化率分別是87.7%,69.3%；時(shí)空產(chǎn)率分別為1.04g·L-1·h-1,1.36g·L-1·h-1。重組菌K.p(pETP3core-tac-puuC)的3-HP產(chǎn)量為目前報(bào)道最高,且在發(fā)酵結(jié)束時(shí),乳酸的產(chǎn)量接近0g/L,這對(duì)于3-HP的實(shí)際生產(chǎn)具有十分重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：3-羥基丙酸 肺炎克雷伯氏菌 復(fù)合啟動(dòng)子 組成型表達(dá)系統(tǒng) 醛脫氫酶 甘油
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-18
• 第一章 緒論18-30
• 1.1 3-羥基丙酸的研究概述18-24
• 1.1.1 性質(zhì)及應(yīng)用18
• 1.1.2 3-羥基丙酸的生產(chǎn)18-19
• 1.1.3 生物合成法生產(chǎn)3-羥基丙酸19-21
• 1.1.4 基因工程菌生產(chǎn)3-羥基丙酸21-22
• 1.1.5 基因工程菌產(chǎn)3-羥基丙酸研究進(jìn)展22-23
• 1.1.6 K. pneumoniae中的甘油代謝途徑23-24
• 1.2 啟動(dòng)子篩選24-27
• 1.2.1 啟動(dòng)子概述24-25
• 1.2.2 啟動(dòng)子工程25-26
• 1.2.3 啟動(dòng)子篩選26-27
• 1.3 復(fù)合啟動(dòng)子27
• 1.4 本課題研究意義27-30
• 第二章 K.pneumoniae高效表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建30-46
• 2.1 引言30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2.2.1 菌株和載體30
• 2.2.2 主要試劑及儀器30-31
• 2.2.3 培養(yǎng)基31-32
• 2.3 試驗(yàn)方法32-37
• 2.3.1 基因組模板的提取32
• 2.3.2 質(zhì)粒載體的提取32-33
• 2.3.3 組成型啟動(dòng)子片段的克隆33
• 2.3.4 目的基因PCR產(chǎn)物回收33-34
• 2.3.5 組成型表達(dá)載體的構(gòu)建34
• 2.3.6 組成型表達(dá)載體的鑒定34-35
• 2.3.7 報(bào)告基因GFP的克隆35
• 2.3.8 以GFP為報(bào)道基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建35-36
• 2.3.9 以GFP為報(bào)道基因的重組質(zhì)粒的鑒定36
• 2.3.10 K.pneumoniae感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化36-37
• 2.3.11 重組菌的篩選與鑒定37
• 2.3.12 重組菌的發(fā)酵培養(yǎng)37
• 2.4 結(jié)果與討論37-43
• 2.4.1 K.pneumoniae DSM2026基因組的提取37-38
• 2.4.2 組成型啟動(dòng)子基因的克隆38-39
• 2.4.3 組成型表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定39-40
• 2.4.4 報(bào)告基因GFP的克隆40
• 2.4.5 以GFP為報(bào)道基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定40-41
• 2.4.6 重組菌的構(gòu)建與鑒定41-42
• 2.4.7 重組菌熒光強(qiáng)度測(cè)定42-43
• 2.5 本章小結(jié)43-46
• 第三章 利用組成型表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)3-HP的研究46-60
• 3.1 引言46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料46-47
• 3.2.1 菌株和載體46
• 3.2.2 主要試劑及儀器46-47
• 3.2.3 培養(yǎng)基47
• 3.3 試驗(yàn)方法47-51
• 3.3.1 獲取基因組47
• 3.3.2 目的基因aldH的克隆47-48
• 3.3.3 重組質(zhì)粒(pETP_(kan)-aldH)的構(gòu)建48-49
• 3.3.4 重組質(zhì)粒(pETP_(kan)-aldH)的鑒定49
• 3.3.5 K.pneumoniae感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化49
• 3.3.6 重組菌K.p(pETPkan-aldH)的篩選與鑒定49
• 3.3.7 重組菌微氧搖瓶發(fā)酵49-50
• 3.3.8 重組菌微氧批式流加發(fā)酵50
• 3.3.9 重組菌生長(zhǎng)曲線繪制50
• 3.3.10 甘油剩余量的測(cè)定50
• 3.3.11 重組菌3-HP及副產(chǎn)物產(chǎn)量50-51
• 3.3.12 重組菌aldH基因的表達(dá)51
• 3.3.13 重組菌酶活測(cè)定51
• 3.4 結(jié)果與討論51-58
• 3.4.1 E.coli DH5α基因組提取51-52
• 3.4.2 目的基因aldH的克隆52
• 3.4.3 重組質(zhì)粒pETP_(kan)-aldH的鑒定52-53
• 3.4.4 重組菌K. p(pETP_(kan)-aldH)的鑒定53-54
• 3.4.5 重組菌醛脫氫酶的表達(dá)54
• 3.4.6 重組菌醛脫氫酶的酶活測(cè)定54-55
• 3.4.7 重組菌微氧搖瓶發(fā)酵產(chǎn)3-HP55-57
• 3.4.8 重組菌上罐發(fā)酵57-58
• 3.5 本章小結(jié)58-60
• 第四章 利用復(fù)合啟動(dòng)子構(gòu)建高效表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)3-HP60-76
• 4.1 引言60
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料60-61
• 4.2.1 菌株和載體60
• 4.2.2 主要試劑及儀器60-61
• 4.2.3 培養(yǎng)基61
• 4.3 試驗(yàn)方法61-66
• 4.3.1 K. pneumoniae基因組的提取61
• 4.3.2 目的基因puuC的克隆61-62
• 4.3.3 質(zhì)粒pET-puuC的構(gòu)建62
• 4.3.4 質(zhì)粒pET-puuC的鑒定62-63
• 4.3.5 目的片段Pntac的合成63
• 4.3.6 重組質(zhì)粒pETPntac-puuC的構(gòu)建63-64
• 4.3.7 重組質(zhì)粒pETPntac-puuC的鑒定64
• 4.3.8 K.pneumoniae感受態(tài)細(xì)胞制備及電轉(zhuǎn)化64
• 4.3.9 重組菌K p(pETPntac-puuC)的篩選與鑒定64
• 4.3.10 重組菌微氧搖瓶發(fā)酵64-65
• 4.3.11 重組菌微氧批式流加發(fā)酵65
• 4.3.12 重組菌生長(zhǎng)曲線繪制65
• 4.3.13 甘油剩余量的測(cè)定65
• 4.3.14 重組菌3-HP及副產(chǎn)物產(chǎn)量65
• 4.3.15 重組菌酶活測(cè)定65-66
• 4.4 結(jié)果與討論66-74
• 4.4.1 目的基因puuC的克隆66
• 4.4.2 質(zhì)粒pET-puuC的鑒定66-67
• 4.4.3 重組質(zhì)粒pETPncore-tac-puuC的測(cè)序鑒定67
• 4.4.4 重組菌K. pneumoniae(pETPncore-tac-puuC)鑒定67-68
• 4.4.5 重組菌微氧搖瓶發(fā)酵產(chǎn)3-HP68-71
• 4.4.6 重組菌酶活測(cè)定71-72
• 4.4.7 重組菌上罐發(fā)酵72-74
• 4.5 本章小結(jié)74-76
• 第五章 總結(jié)與建議76-80
• 5.1 結(jié)論76-77
• 5.2 創(chuàng)新點(diǎn)77
• 5.3 問題與建議77-80
• 參考文獻(xiàn)80-86
• 附錄1. 本研究用到的試劑86-88
• 附錄2 本研究所用到的儀器88-90
• 附錄3 本研究所用到的引物90-92
• 致謝92-94
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄94-96
• 作者和導(dǎo)師簡(jiǎn)介96-97
• 附件97-98

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 張鴻達(dá);劉成;高衛(wèi)華;鄒少蘭;張敏華;;微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3 羥基丙酸的研究進(jìn)展[J];化工進(jìn)展;2007年01期

2 張智清,姚立紅,侯云德;含P_RP_L啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用[J];病毒學(xué)報(bào);1990年02期

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本文編號(hào)：987188