本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌逃避溶酶體作用機(jī)制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 布魯氏菌 DK63-887和BMEI1135基因 生存能力 自噬 溶酶體

【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)是由感染人和動(dòng)物的布魯氏菌(Brucella)造成的對(duì)社會(huì)安全有嚴(yán)重危害的人畜共患病,特別是在經(jīng)濟(jì)較為落后的國家。布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌,其能促進(jìn)自噬發(fā)生和逃避溶酶體的融合,獲得在宿主內(nèi)的復(fù)制和繁殖的能力。IV型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion systems,T4SS)是布魯氏菌關(guān)鍵的毒力因子之一,其在機(jī)體與布魯氏菌相互作用中能分泌多種效應(yīng)蛋白。已有研究確定了11種布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白,其中Tcp B、Cst A和Ric A的功能較清楚,但其他T4SS效應(yīng)蛋白的毒力表型及其調(diào)控機(jī)制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌T4SS效應(yīng)蛋白基因DK63-887、BMEI1135為研究對(duì)象,通過探討其對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌存活能力的影響及與布魯氏菌介導(dǎo)的自噬、逃避溶酶體融合的影響,為揭示細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機(jī)制提供依據(jù),同時(shí)為相關(guān)疫病的預(yù)防、控制工作奠定理論基礎(chǔ)。目的:本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對(duì)象,探討T4SS效應(yīng)蛋白基因DK63-887、BMEI1135的功能及其在布魯氏菌致病過程中的作用機(jī)制。(1)構(gòu)建DK63-887、BMEI1135基因的突變株,初步分析其生存能力。(2)探討IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因?qū)ρ蚍N布魯氏菌16M介導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響。(3)初步探究IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因?qū)ρ蚍N布魯氏菌16M逃避溶酶體融合的影響。方法:(1)以16M為模板來分別擴(kuò)增DK63-887、BMEI1135基因的上下游同源臂,以p UC19K質(zhì)粒為模板擴(kuò)增卡那霉素抗性基因;采用融合PCR和抗性替換技術(shù),將以上片段融合,并連接載體p MD18-T Simple,構(gòu)建突變載體;之后將其電轉(zhuǎn)化至16M感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),進(jìn)行PCR鑒定。將親本株16M、疫苗株M5-90、突變株16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135在相同條件下震蕩培養(yǎng),觀察其生長趨勢(shì)變化以及置于不同應(yīng)激環(huán)境中觀察其生存率;將各菌株侵染以100:1的MOI小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,在不同時(shí)間點(diǎn)分析其在胞內(nèi)的存活能力;用106CFU劑量腹腔注射接種BALB/c小鼠,分析其在體內(nèi)生存能力。(2)布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞RAW264.7 24 h后,利用投射電鏡觀察自噬泡的數(shù)量;利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測自噬ULK1、Beclin1基因m RNA和蛋白的表達(dá);親本株和突變株侵染穩(wěn)定表達(dá)p EGFP-LC3的小鼠巨噬細(xì)胞12 h,利用共聚焦顯微鏡觀察自噬點(diǎn)形成情況。(3)構(gòu)建能夠表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌,侵染巨噬細(xì)胞RAW264.7,在24 h時(shí)用紅色探針分別對(duì)溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色,利用激光共聚焦觀察布魯氏菌分別與溶酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位情況。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了T4SS效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因的突變株116MΔDK63-887、16MΔBMEI1135,在20代內(nèi)遺傳性穩(wěn)定;突變株和親本株的體外生長趨勢(shì)相符合;體外刺激結(jié)果顯示,突變株對(duì)酸、堿、高鹽、熱應(yīng)激、營養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低;在感染小鼠巨噬細(xì)胞4、12、24和48 h時(shí),突變株在胞內(nèi)存活能力和突變株免疫小鼠第4-10周,小鼠脾臟載菌量的均極顯著低于親本株16M組(P0.01);(2)細(xì)胞自噬結(jié)果發(fā)現(xiàn)在12 h時(shí)16MΔDK63-887、16MΔBMEI1135組的綠色熒光顆粒顯著降低(P0.01);在24 h時(shí)突變株組細(xì)胞中Beclin1和ULK1 m RNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平均顯著低于16M組(P0.01);與親本株16M相比較,突變株組中細(xì)胞包含自噬泡也明顯減少(P0.01);(3)親本株和突變株侵染細(xì)胞24 h時(shí)突變株組胞內(nèi)的布氏小體與溶酶體共定位比例明顯升高(P0.01),而與高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位的比例較親本株16M均極顯著減少(P0.01)。結(jié)論:(1)IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因缺失之后,可顯著降低16M在宿主體內(nèi)和體外的存活,從而可提高宿主的細(xì)胞免疫抵抗16M感染;(2)DK63-887、BMEI1135基因缺失之后可顯著抑制16M介導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞自噬。(3)DK63-887、BMEI1135基因缺失之后利于16M與溶酶體的融合,降低其到達(dá)高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)場所的菌量。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 DK63-887和BMEI1135基因 生存能力 自噬 溶酶體
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述 布魯氏菌分子致病機(jī)制的研究進(jìn)展13-25
• 1 布魯氏菌的生物學(xué)特性13-14
• 2 布魯氏菌毒力因子14-19
• 2.1 表面分子14-15
• 2.2 Ⅳ型分泌系統(tǒng)15-16
• 2.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)16
• 2.4 二元調(diào)控系統(tǒng)16-17
• 2.5 小調(diào)控RNA和熱休克蛋白17-18
• 2.6 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)18
• 2.7 其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子18-19
• 3 布魯氏菌胞內(nèi)生存機(jī)制的研究19-22
• 3.1 布魯氏菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲作用19-20
• 3.2 布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸20-21
• 3.3 布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制21-22
• 4 布魯氏菌與細(xì)胞自噬22-25
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究25-89
• 實(shí)驗(yàn)一 布魯氏菌 Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因缺失突變株的構(gòu)建與生存能力分析25-57
• 1 材料與方法26-41
• 1.1 材料26-27
• 1.2 方法27-41
• 2 結(jié)果41-54
• 2.1 羊布魯氏菌強(qiáng)毒株 16M的鑒定41-42
• 2.2 目的基因N端和C端的PCR擴(kuò)增42-44
• 2.3 同源重組序列的融合44-45
• 2.4 突變株突變載體的構(gòu)建45
• 2.5 突變株的篩選和鑒定45-47
• 2.6 缺失株 16M△DK63-887、16M△BMEI1135的遺傳穩(wěn)定性檢測47-50
• 2.7 生長曲線50-51
• 2.8 布魯氏菌在外界應(yīng)激條件下的生存能力51-52
• 2.9 布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力52-53
• 2.10 小鼠脾臟CFU計(jì)數(shù)檢測突變株的毒力53-54
• 3 討論54-55
• 3.1 本研究中構(gòu)建布魯氏菌缺失突變株方法的優(yōu)點(diǎn)54
• 3.2 電轉(zhuǎn)化效率的優(yōu)化54-55
• 3.3 布魯氏菌 16M△DK63-887、16M△BMEI1135生存能力的分析55
• 4 小結(jié)55-57
• 實(shí)驗(yàn)二 Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因?qū)Σ剪斒暇?16M介導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響57-74
• 1 材料與方法58-64
• 1.1 材料58-59
• 1.2 方法59-64
• 2 結(jié)果64-72
• 2.1 透射電鏡觀察巨噬細(xì)胞中的自噬體和溶酶體結(jié)構(gòu)64-66
• 2.2 熒光倒置顯微鏡觀察GFP-LC3 puncta陽性細(xì)胞66-69
• 2.3 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ULK1 m RNA轉(zhuǎn)錄水平檢測69-70
• 2.4 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ULK1蛋白水平檢測70-72
• 3 討論72-73
• 3.1 自噬的監(jiān)測手段72-73
• 3.2 布魯氏菌與自噬73
• 4 小結(jié)73-74
• 實(shí)驗(yàn)三 Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白DK63-887、BMEI1135基因?qū)Σ剪斒暇?16M逃避細(xì)胞內(nèi)溶酶體融合的影響74-89
• 1 材料與方法75-79
• 1.1 材料75-76
• 1.2 方法76-79
• 2 結(jié)果79-87
• 2.1 GFP-16M、16M△DK63-887、16M△BMEI1135的篩選與鑒定79-80
• 2.2 觀察GFP-16M、GFP-16M△DK63-887、GFP-16M△BMEI1135在細(xì)胞內(nèi)的熒光表達(dá)效果80
• 2.3 GFP-16M、GFP-16M△DK63-887、GFP-16M△BMEI1135侵染巨噬細(xì)胞觀察其與溶酶體共定位情況80-82
• 2.4 GFP-16M、GFP-16M△DK63-887、GFP-16M△BMEI1135侵染巨噬細(xì)胞觀察其與高爾基體共定位情況82-84
• 2.5 GFP-16M、GFP-16M△DK63-887、GFP-16M△BMEI1135侵染巨噬細(xì)胞觀察其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)共定位情況84-87
• 3 討論87-88
• 3.1 DK63-887、BMEI1135對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌與溶酶體融合的影響87
• 3.2 DK63-887、BMEI1135對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌與高爾基體融合的影響87-88
• 3.3 DK63-887、BMEI1135對(duì)胞內(nèi)布魯氏菌與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合的影響88
• 4 小結(jié)88-89
• 全文結(jié)論89-90
• 創(chuàng)新點(diǎn)90-91
• 參考文獻(xiàn)91-102
• 致謝102-103
• 作者簡介103
• 文章發(fā)表情況103-104
• 石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱表104

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本文編號(hào)：985940