本文關(guān)鍵詞：Sf9昆蟲細胞宿主蛋白含量雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

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【摘要】：目的建立Sf9昆蟲細胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量雙抗體夾心ELISA檢測方法。方法從Sf9昆蟲細胞中提取總蛋白,免疫家兔,制備兔抗Sf9細胞總蛋白多克隆抗體,經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀和CL-4B層析柱純化后,采用SDS-PAGE分析抗體純度,間接ELISA法檢測抗體效價,Western blot法檢測抗體特異性;用純化的多克隆抗體作為包被抗體,采用改良過碘酸鈉法將HRP酶標記至純化的抗體上作為酶標抗體,采用方陣滴定法確定雙抗體夾心ELISA方法的最適工作條件。確定該方法的最佳線性范圍及最低檢測限,驗證該方法的準確度及精密度。將表達戊型肝炎ORF2基因的重組桿狀病毒感染Sf9細胞,收獲病毒培養(yǎng)上清,制備3批純化的重組蛋白,用建立的方法檢測純化過程中HCP含量的變化,驗證其在純化工藝中的適用性。與商品化試劑盒進行比較,檢測兩種方法的靈敏度及在制品中的適用性。結(jié)果純化后的兔抗Sf9細胞總蛋白多克隆抗體純度達90%以上,抗體效價為1∶10 000,可與Sf9細胞蛋白特異性結(jié)合。建立的雙抗體夾心法ELSA方法最佳抗體包被濃度為20μg/ml,37℃孵育1 h;酶標抗體的工作濃度為1∶200,37℃孵育1 h;TMB室溫顯色30 min;測定各孔A450值。該方法的最佳線性范圍為50~1 600 ng/ml,最低檢測為50 ng/ml;不同濃度的Sf9細胞蛋白抗原回收率在87.8%~117%之間,變異系數(shù)均小于10%;制備的3批重組蛋白經(jīng)超濾及層析純化后,HCP含量均逐漸降低至小于50 ng/ml,純化工藝可有效去除HCP;與商品化試劑盒比較,該方法更適用于檢測戊肝類病毒顆粒樣品。結(jié)論已成功建立Sf9昆蟲細胞殘余蛋白含量檢測的雙抗體夾心法ELSA方法,可用于檢測Sf9昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)純化的重組蛋白中HCP含量。
【作者單位】： 北京生物制品研究所有限責(zé)任公司;
【關(guān)鍵詞】： Sf昆蟲細胞 宿主蛋白 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定
【分類號】：R392-33
【正文快照】： 昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達和研究中,與大腸埃希菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)并稱為基因工程四大表達系統(tǒng)。常用的昆蟲細胞株有Sf9、high5、S2等。用昆蟲細胞/桿狀病毒表達系統(tǒng)重組的人用疫苗CER-VARIX(英國GSK公司)和PROVENGE(美國Den-dreon

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本文編號：961705