本文關(guān)鍵詞：Sox30基因在小鼠和大鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)與甲基化分析

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【摘要】：立題背景:大量研究已經(jīng)表明,表觀遺傳修飾改變?cè)诎l(fā)育過程中起著關(guān)鍵作用。其中,DNA甲基化是目前研究最多和最為深入的表觀遺傳修飾方式之一。越來越多的證據(jù)表明,DNA甲基化主要通過調(diào)控發(fā)育過程中組織特異性基因的時(shí)空表達(dá),維持著生物體正常的發(fā)育進(jìn)程。DNA甲基化變化一旦發(fā)生異常往往與發(fā)育中出現(xiàn)的多種疾病狀態(tài)密切相關(guān)。因此,開展發(fā)育相關(guān)基因表觀遺傳修飾方式的研究,有助于闡明疾病的發(fā)病機(jī)制,對(duì)深入認(rèn)識(shí)相關(guān)疾病具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。Sox30(SRY-box containing gene 30)作為Sox核轉(zhuǎn)錄因子基因超家族的成員,一直被認(rèn)為只在高等脊椎動(dòng)物尤其是哺乳動(dòng)物中存在,而在低等脊椎動(dòng)物中并不存在。而我們最近的研究表明,Sox30基因在整個(gè)動(dòng)物界中普遍存在,這一發(fā)現(xiàn)意味著Sox30基因可能比先前認(rèn)為的更加重要。已有研究顯示,Sox30基因主要在睪丸生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞中表達(dá),可能參與了性腺發(fā)育、精原細(xì)胞分化和精子形成過程。最近,我們又首次發(fā)現(xiàn)Sox30基因在肺癌中是一個(gè)新的受DNA甲基化調(diào)控的腫瘤抑制基因,其作用機(jī)制是通過轉(zhuǎn)錄激活p53信號(hào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮抑制功能。然而,Sox30基因在小鼠和大鼠發(fā)育過程中的具體表達(dá)變化模式以及其表達(dá)是否受DNA甲基化調(diào)控目前還不清楚。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)明確Sox30基因在成體小鼠和大鼠各種組織中表達(dá)情況;明確Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎發(fā)育全胚和發(fā)育各階段卵巢及睪丸組織中的表達(dá)變化;(2)了解Sox30基因在成體小鼠和大鼠各種組織中的DNA甲基化發(fā)生情況,以及Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎發(fā)育和出生后發(fā)育各階段睪丸組織中的DNA甲基化變化情況;(3)確定Sox30基因在小鼠和大鼠發(fā)育過程的睪丸組織中的表達(dá)和DNA甲基化之間的關(guān)系。(1)采用rt-pcr、rt-qpcr、wb和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)sox30基因在成體小鼠和大鼠各種組織中以及發(fā)育各階段睪丸組織中的表達(dá)和定位情況;(2)采用甲基化特異性pcr(msp)結(jié)合亞硫酸氫鹽修飾測(cè)序方法檢測(cè)sox30基因在成體小鼠和大鼠各種組織以及發(fā)育各階段睪丸組織中的dna甲基化情況;(3)通過rt-pcr、rt-qpcr、msp和bsp方法檢測(cè)生殖系統(tǒng)來源的多種細(xì)胞株經(jīng)過去甲基化藥物(甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑)5-aza-c處理前后sox30基因表達(dá)水平和dna甲基化狀態(tài)的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)本研究通過檢測(cè)sox30基因在成體小鼠和大鼠的卵巢、子宮、附睪、睪丸、心臟、腦、肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、肺、肌肉、腸、垂體、血液和海馬組織中的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),在成體小鼠,sox30基因在睪丸組織中的表達(dá)量最高,其次是在附睪組織和肺組織中,且sox30在睪丸組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在附睪和肺組織中的表達(dá);在成體大鼠,sox30也是在睪丸中的表達(dá)量最高,其次是在附睪和血液中,且sox30在睪丸組織中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在附睪和血液中的表達(dá)。這些結(jié)果說明sox30基因在小鼠和大鼠睪丸的功能維持或精子發(fā)生中具有重要作用。(2)sox30基因在小鼠和大鼠發(fā)育階段e8.5(胚胎期8.5天)、e10.5、e12.5、e14.5、e15.5、e19.5全胚胎及1d(出生后1天)、4d、7d、10d、15d、20d、30d、40d、60d和73d的卵巢和睪丸組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),在小鼠中,sox30在胚胎期e8.5、10.5、12.5全胚胎中表達(dá)較低,在e14.5時(shí)表達(dá)量明顯升高,在從出生后1d到60d成鼠卵巢組織中都呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài),而在從出生后1d到60d成鼠的睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高,直到60天達(dá)到峰值,并在出生后15d的睪丸組織中呈現(xiàn)爆發(fā)式升高,高于出生后10d時(shí)睪丸組織中的表達(dá)近30倍;在大鼠中,sox30在胚胎期e8.5、10.5、12.5、15.5、19.5雄性和19.5雌性全胚胎中均呈低表達(dá)狀態(tài),在從出生后1d到73d成鼠卵巢組織中表達(dá)低或不表達(dá),從出生后1d到40d大鼠的睪丸組織中表達(dá)量逐漸升高,到40天時(shí)達(dá)到峰值,以后維持在峰值水平。這些數(shù)據(jù)表明,sox30基因在小鼠和大鼠的性別分化和睪丸發(fā)育過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。(3)通過檢測(cè)sox30基因在小鼠睪丸中的細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),sox30不僅在小鼠睪丸生殖細(xì)胞中表達(dá),還在睪丸支持細(xì)胞中表達(dá),只是在生殖細(xì)胞中的表達(dá)量高于在支持細(xì)胞中的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示,sox30基因參與了生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟,在睪丸發(fā)揮正常功能中具有重要作用。(4)通過分析sox30基因在成體小鼠各組織中的dna甲基化情況發(fā)現(xiàn),sox30在實(shí)驗(yàn)方法:卵巢、心臟、大腦、肝臟、腎臟、脾臟、胰臟、肌肉和小腸組織中都是甲基化狀態(tài),而在附睪、睪丸和肺組織中則是非甲基化狀態(tài)�？紤]到前期的Sox30基因的組織分布表達(dá)結(jié)果,我們認(rèn)為Sox30基因在成體小鼠組織中的甲基化與表達(dá)密切相關(guān)。(5)通過檢測(cè)Sox30基因在小鼠和大鼠發(fā)育各階段睪丸組織中的DNA甲基化情況發(fā)現(xiàn),Sox30基因在睪丸發(fā)育過程中DNA甲基化程度逐漸降低,直到發(fā)生去甲基化,而其在同時(shí)期的表達(dá)則逐漸升高,直到達(dá)到峰值。這些結(jié)果表明,Sox30基因在小鼠和大鼠胚胎和睪丸發(fā)育中的表達(dá)明顯受到其甲基化程度的調(diào)控。(6)通過對(duì)Sox30不表達(dá)和發(fā)生甲基化的生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞株進(jìn)行去甲基化藥物5-aza-C處理后,在Sox30發(fā)生去甲基化的細(xì)胞中,其表達(dá)得到了明顯恢復(fù)。這些數(shù)據(jù)顯示,Sox30基因的表達(dá)明顯受到了DNA甲基化的直接調(diào)控。結(jié)論:在小鼠和大鼠睪丸發(fā)育過程中,Sox30基因表達(dá)與雄性性別決定時(shí)間點(diǎn)明顯相關(guān),同時(shí)在成體主要表達(dá)于睪丸組織而在卵巢中不表達(dá),提示與睪丸功能以及精子發(fā)育密切相關(guān)。Sox30基因的表達(dá)受其DNA甲基化的調(diào)控,這種嚴(yán)格的調(diào)控模式與睪丸組織正常發(fā)育和發(fā)揮特定功能密切相關(guān)。因此,Sox30基因是一個(gè)值得深入研究的與睪丸發(fā)育相關(guān)的重要基因。
【關(guān)鍵詞】：Sox30 睪丸發(fā)育 基因表達(dá) DNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R339.21
【目錄】：

• 英文縮略詞4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 Sox30基因在小鼠和大鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)分析15-28
• 2.1 材料和方法15-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-26
• 2.3 討論26-28
• 第三章 Sox30基因在小鼠和大鼠睪丸發(fā)育過程中的甲基化分析28-39
• 3.1 材料和方法28-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-36
• 3.3 討論36-39
• 第四章 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Sox30表達(dá)和甲基化的調(diào)控關(guān)系39-44
• 4.1 材料和方法39-40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-42
• 4.3 討論42-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述 Sox30基因在睪丸決定、分化和生殖能力維持中作用的研究進(jìn)展49-61
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 發(fā)表論文情況61-62
• 致謝62

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 馬學(xué)翔;Sox30基因在小鼠和大鼠睪丸發(fā)育過程中的表達(dá)與甲基化分析[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：913413