本文關(guān)鍵詞：C型凝集素受體Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體制備

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【摘要】：目的克隆人C型凝集素受體dectin-2和dectin-3胞外區(qū)基因并進(jìn)行原核表達(dá)及制備它們的單克隆抗體。方法利用PCR擴(kuò)增編碼人dectin-2和dectin-3胞外區(qū)的基因序列,分別克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中,IPTG誘導(dǎo)基因的原核表達(dá);純化后免疫Balb/c小鼠,融合并篩選獲得克隆化的雜交瘤細(xì)胞株,制備Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體;利用ELISA、FACS和Western印跡法檢測(cè)抗體的效價(jià)和特異性;檢測(cè)Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體是否能夠特異性阻斷相應(yīng)受體的功能。結(jié)果成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Dectin-2和pET28a(+)-Dectin-3,并在E.coli BL21(DE3)中誘導(dǎo)Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)的高效表達(dá)。純化目的蛋白后免疫Balb/c小鼠,融合獲得8株Dectin-2和12株Dectin-3的陽性雜交瘤細(xì)胞。進(jìn)一步克隆化篩選獲得7株Dectin-2和8株Dectin-3的單克隆細(xì)胞株,并且其分泌的抗體能夠特異結(jié)合Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)的原核表達(dá)蛋白。利用單克隆細(xì)胞株制備小鼠腹水,純化獲得Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體。單克隆細(xì)胞株D2-7和D3-2產(chǎn)生的抗體能夠特異結(jié)合RAW中表達(dá)的人Dectin-2和Dectin-3蛋白及小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞中Dectin-2和Dectin-3蛋白。抗體功能實(shí)驗(yàn)顯示:單克隆細(xì)胞株D2-7和D2-10產(chǎn)生的抗體能夠阻斷Dectin-2受體介導(dǎo)白念珠菌菌絲態(tài)刺激引起的NF-κB激活,而單克隆細(xì)胞株D3-1和D3-2產(chǎn)生的抗體能夠阻斷Dectin-3受體介導(dǎo)白念珠菌菌絲態(tài)刺激引起的NF-κB激活,并且具有劑量依賴性及高度特異性。結(jié)論成功獲得高純度的Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白,并分別獲得了特異、高效價(jià)的單克隆抗體。
【作者單位】： 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室;
【關(guān)鍵詞】： C型凝集素受體 Dectin-蛋白 Dectin-蛋白 單克隆抗體
【基金】：上海市基礎(chǔ)研究重點(diǎn)基金(12JC1408400)
【分類號(hào)】：R392.11
【正文快照】： C型凝集素受體(C-type lectin receptor,CLR)是一類模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR),可以識(shí)別病原體細(xì)胞壁上的糖成分,在抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。Dectin-2(dendritic cell-associated C-type lectin-2)和Dectin-3(dendritic cell-associated C-type lectin

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：898195