發(fā)布時(shí)間：2017-09-19 23:17

  本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲兩種酪氨酸酶的克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)錄特異性分析

  更多相關(guān)文章： 日本血吸蟲 酪氨酸酶 克隆 表達(dá) 轉(zhuǎn)錄特異性

【摘要】：目的克隆、表達(dá)日本血吸蟲2種酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全長(zhǎng)基因,并研究這2種基因在日本血吸蟲不同性別和不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄特異性。方法設(shè)計(jì)特異性引物,從日本血吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出SjTYR1和SjTYR2的全長(zhǎng)片段,并克隆入原核表達(dá)載體pSJ2,驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌(E.coli)Rosetta Gami細(xì)胞,使用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),并用組氨酸標(biāo)簽對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化。將純化后獲得的重組蛋白SjTYR1和SjTYR2分別免疫新西蘭白兔制備免疫兔血清。分別以重組蛋白免疫兔血清和日本血吸蟲感染兔血清為一抗,用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析重組蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性;以重組蛋白免疫兔血清為一抗,用Western blotting觀察其與日本血吸蟲蟲體蛋白的反應(yīng)情況。制備感染后14、16、18、20、22、24、26和28 d雌蟲和雄蟲的總RNA,利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸蟲不同性別及不同發(fā)育時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體SjTYR1/pSJ2和SjTYR2/pSJ2,誘導(dǎo)后獲得包涵體形式表達(dá)的重組蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分別為55 000和56 800,與預(yù)測(cè)的融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相符。純化后的重組蛋白SjTYR1可被日本血吸蟲感染兔血清識(shí)別,而SjTYR2則不能。rSjTYR1免疫兔血清與蟲體蛋白反應(yīng)后,可見一條約Mr100 000的條帶,rSjTYR2免疫兔血清不與蟲體蛋白反應(yīng)。在雄蟲體內(nèi),2種酪氨酸酶均不轉(zhuǎn)錄;在雌蟲體內(nèi),2種酪氨酸酶在感染后24 d內(nèi)不轉(zhuǎn)錄,自24 d開始出現(xiàn)激增,之后逐漸提高,感染后28 d達(dá)到相對(duì)最大值。結(jié)論構(gòu)建了SjTYR1和SjTYR2的重組質(zhì)粒并表達(dá),2種重組蛋白均具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。SjTYR1和SjTYR2在血吸蟲雌蟲中特異表達(dá),且在感染終宿主后24~28 d轉(zhuǎn)錄水平升高。
【作者單位】： 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所 衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心;復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系;
【關(guān)鍵詞】： 日本血吸蟲 酪氨酸酶 克隆 表達(dá) 轉(zhuǎn)錄特異性
【基金】：國(guó)家傳染病科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX1004-302)~~
【分類號(hào)】：R383.24
【正文快照】： 血吸蟲病被認(rèn)為是一種免疫性疾病[1]。血吸蟲雌蟲產(chǎn)卵沉積在宿主組織器官并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫病理反應(yīng)是血吸蟲致病的一個(gè)重要因素[2]。吸蟲類蟲卵的形成依靠交聯(lián)蛋白的硬化和鞣制[3,4],酪氨酸酶在蛋白交聯(lián)中發(fā)揮關(guān)鍵的催化作用。酪氨酸酶是一種銅離子螯合酶,催化單酚臨位羥基

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7 錢e，

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