本文關(guān)鍵詞：Resistin與肥胖性2型糖尿病恒河猴模型相關(guān)性及其參與病理發(fā)生的分子機制研究

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【摘要】：目的：抵抗素(Resistin,RETN)是一類由脂肪細(xì)胞特異性分泌的激素樣脂肪細(xì)胞因子,是2型糖尿病(T2DM)胰島素抵抗治療的一個潛在靶點。由于目前其基因功能和生物學(xué)特性還沒有完全清楚,而且在參與胰島素抵抗中的生物學(xué)功能的研究結(jié)果發(fā)生了分歧,因而我們選用與人類較為接近的恒河猴作為研究對象,對Resistin與T2DM的相關(guān)性和參與病理發(fā)生的分子機制進(jìn)行初步探索。方法：用高糖高脂飲食誘導(dǎo)肥胖性T2DM恒河猴模型,對其血清Resistin水平進(jìn)行測定,并進(jìn)行與T2DM部分臨床指標(biāo)以及胰島素敏感性相關(guān)性分析。隨后克隆恒河猴Resistin的全長基因開放閱讀框,并將其構(gòu)建在慢病毒載體上。將重組慢病毒感染人肝癌細(xì)胞Huh-7,并通過基因芯片技術(shù)篩選受表達(dá)調(diào)控的基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)果：Resistin與肥胖性T2DM恒河猴的總膽固醇、低密度脂蛋白-膽固醇、空腹血糖、空腹胰島素、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)存在正相關(guān)性,而與胰島β細(xì)胞功能存在負(fù)相關(guān)性。通過慢病毒介導(dǎo)恒河猴Resistin在Huh-7細(xì)胞中的過表達(dá),并運用基因芯片篩選到了與cAMP信號通路相關(guān)的IL6、VIP等15個基因受到了Resistin的調(diào)控,包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)肝糖原分解、促炎癥和影響胰島素敏感性的基因。結(jié)論：Resistin與T2DM密切相關(guān),可能通過cAMP第二信使激活下游的信號通路(MAPK、ERK、AKT等)調(diào)控促炎癥因子、細(xì)胞凋亡因子等的表達(dá),從而啟動細(xì)胞氧化應(yīng)急反應(yīng)誘導(dǎo)功能細(xì)胞凋亡并負(fù)向參與和干擾了T2DM機體糖代謝的過程。
【關(guān)鍵詞】：2型糖尿病 抵抗素 胰島素抵抗 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R589.2;R-332
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstact8-10
• 前言10-13
• 第一部分 血清Resistin與肥胖性T2DM恒河猴模型的相關(guān)性分析13-36
• 一、肥胖性T2DM恒河猴模型的構(gòu)建13-26
• 1 實驗材料13-14
• 1.1 實驗動物13
• 1.2 飼料配方13-14
• 1.3 試劑與耗材14
• 1.4 儀器設(shè)備14
• 2 實驗方法14-17
• 2.1 高糖高脂飲食誘導(dǎo)恒河猴高脂血癥和肥胖癥14-15
• 2.2 低劑量STZ誘發(fā)肥胖性T2DM恒河猴模型及評價15-16
• 2.3 組織病理學(xué)檢測16-17
• 3 結(jié)果17-25
• 3.1 體重、血脂、空腹血糖、胰島素、C肽以及胰島素抵抗指數(shù)臨床指標(biāo)監(jiān)測結(jié)果17
• 3.2 葡萄糖耐量試驗和胰島素耐受試驗17-21
• 3.3 尿糖的定性檢測21-22
• 3.4 T2DM胰島素抵抗相關(guān)細(xì)胞因子Resistin檢測22
• 3.5 胰腺、肝臟和腎臟的組織病理學(xué)分析22-24
• 3.6 胰島組織病理學(xué)分析24
• 3.7 肝臟組織糖原染色分析結(jié)果24-25
• 4 討論25-26
• 二、血清Resistin與肥胖性T2DM臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析及其在糖代謝中的釋放特征26-36
• 1 實驗材料26-27
• 1.1 實驗動物26-27
• 1.2 試劑與耗材27
• 1.3 儀器設(shè)備27
• 2 實驗方法27-28
• 2.1 誘導(dǎo)T2DM模型27-28
• 2.2 血清Resistin與T2DM恒河猴模型的血脂、血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)和β細(xì)胞功能的相關(guān)性分析28
• 2.3 血清Resistin在T2DM恒河猴模型葡萄糖代謝過程中的變化28
• 3 結(jié)果28-34
• 3.1 T2DM猴血脂、血糖、糖化血紅蛋白、胰島素等指標(biāo)檢測結(jié)果28-29
• 3.2 血清Resistin與T2DM恒河猴模型的血脂、血糖、糖化血紅蛋白、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)和β細(xì)胞功能的相關(guān)性分析結(jié)果29-31
• 3.3 葡萄糖耐量試驗31
• 3.4 在葡糖糖耐量試驗中對血糖、胰島素和Resistin釋放的變化曲線AUC計算結(jié)果31
• 3.5 對照組與T2DM組的組內(nèi)比較31-34
• 4 討論34-36
• 第二部分 恒河猴Resistin基因的克隆與慢病毒載體的構(gòu)建36-58
• 一、恒河猴Resistin基因克隆及分析36-46
• 1 實驗材料36-37
• 1.1 實驗動物36
• 1.2 試劑與耗材36-37
• 1.3 儀器設(shè)備37
• 2 實驗方法37-41
• 2.1 引物設(shè)計與合成37
• 2.2 總RNA的提取37-38
• 2.3 cDNA的合成38
• 2.4 恒河猴Resistin基因的擴增38-39
• 2.5 膠回收PCR產(chǎn)物39-40
• 2.6 酶切,連接和轉(zhuǎn)化40-41
• 2.7 提取質(zhì)粒41
• 2.8 用XbaI和PstI雙酶切鑒定.41
• 2.9 測序及序列分析41
• 3 結(jié)果41-46
• 3.1 脂肪組織和胰腺組織總RNA抽提及檢測結(jié)果41-42
• 3.2 Resistin基因的PCR擴增結(jié)果42
• 3.3 Resistin基因克隆及鑒定結(jié)果42-44
• 3.4 測序及序列分析結(jié)果44-46
• 二、恒河猴Resistin重組慢病毒載體的構(gòu)建及包裝46-58
• 1 實驗材料46-47
• 1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞46
• 1.2 試劑與耗材46
• 1.3 儀器設(shè)備46-47
• 1.4 PCR引物設(shè)計與合成47
• 2 實驗方法47-50
• 2.1 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重組質(zhì)粒的建立47-48
• 2.2 293T細(xì)胞的復(fù)蘇48
• 2.3 293T細(xì)胞的傳代48
• 2.4 慢病毒載體的轉(zhuǎn)染48-49
• 2.5 攜帶macRETN基因重組慢病毒顆粒的電鏡檢測49
• 2.6 qPCR法測定慢病毒滴度49-50
• 3 結(jié)果50-57
• 3.1 macRETN ORF擴增結(jié)果50
• 3.2 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro重組質(zhì)粒酶切及測序鑒定結(jié)果50-52
• 3.3 macRETN-PLV-EF1a-EGFP[2A]Puro慢病毒顆粒的包裝及收獲52
• 3.4 攜帶macRETN基因重組慢病毒的滴度測定結(jié)果52-55
• 3.5 攜帶macRETN基因重組慢病毒顆粒的電鏡檢測結(jié)果55
• 3.6 攜帶macRETN基因重組慢病毒在293T細(xì)胞中的感染效率55
• 3.7 macRETN基因在293T細(xì)胞中mRNA水平的表達(dá)檢測結(jié)果55-57
• 4 討論57-58
• 第三部分 恒河猴Resistin對人肝細(xì)胞葡萄糖代謝的調(diào)控58-75
• 1 實驗材料58-59
• 1.1 細(xì)胞株58
• 1.2 試劑與耗材58
• 1.3 儀器設(shè)備58-59
• 1.4 引物59
• 2 實驗方法59-65
• 2.1 Huh-7細(xì)胞的復(fù)蘇59-60
• 2.2 Huh-7細(xì)胞的傳代60
• 2.3 Huh-7細(xì)胞的凍存60-61
• 2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染61
• 2.5 PCR檢測61
• 2.6 葡萄糖吸收實驗61
• 2.7 用 Qiagen RNeasy® Mini Kit 和 RNase-Free DNase Set試劑盒提取細(xì)胞的 RNA61-62
• 2.8 Qiagen RT2 First Strand 試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一條 cDNA62-63
• 2.9 cDNA濃度的測定63-64
• 2.10 基因芯片分析64-65
• 2.11 差異基因的顯著性分析65
• 3 結(jié)果65-71
• 3.1 macRETN重組慢病毒感染Huh-7人肝細(xì)胞對報告基因eGFP熒光檢測結(jié)果65
• 3.2 PCR檢測結(jié)果65
• 3.3 葡萄糖吸收實驗65-68
• 3.4 cDNA濃度的測定68
• 3.5 實時定量PCR特異性檢驗68-69
• 3.6 基因芯片的數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制69
• 3.7 看家基因的選擇結(jié)果69
• 3.8 基因芯片的差異性基因分析69-71
• 3.9 基因的差異顯著性分析71
• 4 討論71-75
• 小結(jié)75
• 展望75-76
• 參考文獻(xiàn)76-83
• 附錄83-88
• 一、縮略詞83-85
• 二、主要溶液及培養(yǎng)基的配制85-88
• 個人簡歷88-89
• 致謝89-90

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 錢榮立;關(guān)于糖尿病新診斷標(biāo)準(zhǔn)與分型的意義[J];臨床內(nèi)科雜志;2000年03期

2 陳浩宇;王水明;彭瑞云;高亞兵;王麗峰;趙黎;左紅艷;董霽;蘇鎮(zhèn)濤;;微波長期輻射對雄性生殖的影響研究[J];中華男科學(xué)雜志;2011年03期

3 陳麗萌,李學(xué)旺,黃利偉,李艷,段琳,張小娟;2型糖尿病小鼠(KKA~y)動物模型的鑒定和早期腎臟病理改變[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;2002年01期

4 朱華宇;張翔;張曉;張瑞;楊安鋼;;miR-203真核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組慢病毒的制備及其對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2013年06期

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本文編號：871472