本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲醛糖還原酶基因RNA干擾效應(yīng)的初步研究

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【摘要】：目的研究siRNA誘導(dǎo)的日本血吸蟲醛糖還原酶(SjAR)基因轉(zhuǎn)錄本和蛋白水平的RNA干擾(RNAi)效應(yīng)。方法設(shè)計并合成2條針對SjAR基因的siRNA(siRNA-1和siRNA-2)和1條陰性對照siRNA(siRNA-NC)。用日本血吸蟲尾蚴感染4~6周齡雌性昆明鼠(800~1 000條/鼠),13 d后灌注小鼠肝門靜脈收集童蟲,每(120±10)條童蟲為一組,分別采用電轉(zhuǎn)法和浸泡法對各組童蟲進(jìn)行RNAi處理。電轉(zhuǎn)處理法:向電擊杯中分別加入5μg siRNA-1、siRNA-2、siRNA-NC或等體積的焦碳酸二乙酯(DEPC)水(空白對照),經(jīng)125 V 20 ms方波脈沖電擊童蟲1次后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h;浸泡處理法:向童蟲培養(yǎng)基中加入siRNA-1、siRNA-2或siRNA-NC溶液至siRNA濃度為200 nmol/L,第3天時更換一半新鮮培養(yǎng)基并補充siRNA,共培養(yǎng)5 d。每處理設(shè)3個平行對照組。干擾結(jié)束后,采用TRIzol法提取蟲體RNA和可溶性總蛋白,將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以SjGAPDH基因為內(nèi)參,實時定量PCR檢測SjAR轉(zhuǎn)錄本相對表達(dá)水平的變化,Western blotting分析SjAR蛋白水平的變化。結(jié)果實時定量PCR結(jié)果顯示,采用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC電轉(zhuǎn)后,蟲體SjAR轉(zhuǎn)錄本水平分別為(90.6±16.2)%、(84.2±7.3)%和(105.9±10.3)%,與空白對照組[(100.9±16.8)%]的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);使用siRNA-1、siRNA-2浸泡后,SjAR轉(zhuǎn)錄本水平為(48.6±8.2)%和(73.4±4.7)%,均較空白對照組[(100.0±3.3%)]顯著下降(P0.01),而陰性對照siRNA-NC浸泡后的蟲體SjAR轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平為(101.43±14.33)%,與空白對照組比較表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blotting分析和條帶定量結(jié)果顯示,以空白對照組為標(biāo)準(zhǔn),使用siRNA-1、siRNA-2和siRNA-NC浸泡后,SjAR蛋白水平分別為79.0%、97.8%和103.2%。結(jié)論使用浸泡法對日本血吸蟲童蟲SjAR進(jìn)行RNAi處理可降低靶基因轉(zhuǎn)錄本和蛋白的表達(dá)水平。
【作者單位】： 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)與微生物工程系;中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所;
【關(guān)鍵詞】： 日本血吸蟲 醛糖還原酶 RNA干擾
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.81271867)~~
【分類號】：R383.24
【正文快照】： 由于復(fù)雜的生活史、種質(zhì)細(xì)胞的難以分離以及無限傳代的細(xì)胞系的缺失,人工誘變等經(jīng)典遺傳學(xué)方法并不適用于血吸蟲的基因功能研究[1]。因此,以RNA干擾(RNAi)為代表的新型反向遺傳學(xué)技術(shù)是當(dāng)前進(jìn)行血吸蟲基因組深入解析所必備的工具。研究表明血吸蟲dicer基因在蟲體發(fā)育的各個時

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本文編號：862074