本文關(guān)鍵詞：早期應(yīng)激損害海馬學(xué)習(xí)記憶突觸功能機(jī)制研究

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【摘要】：留守兒童心理和情緒的問(wèn)題往往容易被注意和觀察到,而認(rèn)知問(wèn)題常常容易被忽略�，F(xiàn)今,越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究結(jié)果顯示,長(zhǎng)期遭受忽略、歧視、謾罵甚至是虐待等傷害性刺激的機(jī)體,其認(rèn)知、決策能力的損害非常嚴(yán)重,包括空間記憶、工作記憶及判定和決策能力等。在生命發(fā)育早期,長(zhǎng)期慢性的不良應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體記憶能力受損至成年。在我國(guó),留守兒童問(wèn)題日益嚴(yán)重,據(jù)我國(guó)第六次人口普查資料報(bào)告顯示,我國(guó)農(nóng)村留守兒童數(shù)量已超過(guò)六千萬(wàn),其中學(xué)齡前留守兒童(0-5歲)占38.37%,且有上升趨勢(shì)。這一群體長(zhǎng)期缺乏、甚至得不到父母的關(guān)愛(ài)和監(jiān)護(hù),大多數(shù)留守兒童長(zhǎng)期生活在充滿傷害性刺激的生活環(huán)境中,很多的留守兒童已經(jīng)存在心理缺陷及情感問(wèn)題,而且智力發(fā)育也嚴(yán)重滯后于正常家庭中成長(zhǎng)的同齡兒童。在國(guó)內(nèi),較多學(xué)者和專家存在著一種定向思維,他們認(rèn)為留守兒童本質(zhì)上其實(shí)是父母與年幼子女分離,在動(dòng)物模型的研究中應(yīng)該選擇母-幼分離動(dòng)物模型最為合適。然而,在國(guó)外,這種定向思維是不準(zhǔn)確的。母-幼分離的動(dòng)物模型不能很好的模擬人類社會(huì)父母與年幼子女間的分離,且國(guó)外該領(lǐng)域的絕大多數(shù)研究結(jié)果已經(jīng)顯示：母-幼分離30分鐘——3小時(shí)(目前的最長(zhǎng)分離時(shí)間)對(duì)幼鼠有益,而不是有害。可能的原因是：母鼠重回鼠籠后對(duì)幼鼠有更多的“愛(ài)撫”刺激。本研究采用國(guó)外一種早年生活應(yīng)激的動(dòng)物模型替代母-幼分離動(dòng)物模型模擬留守兒童長(zhǎng)期遭受慢性應(yīng)激,并運(yùn)用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)及行為學(xué)的研究方法觀察傷害性刺激對(duì)海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘和興奮性突觸發(fā)育、成熟和穩(wěn)定的影響。目的1、在P9/P21/P120天,分別稱量、記錄幼鼠的體重與全腦、胸腺、腎上腺等器官的質(zhì)量；2、觀察早期應(yīng)激導(dǎo)致母獸-幼崽(dam-pups)行為的變化,包括1h觀察時(shí)間內(nèi)dam-pups間哺乳情況、dam離巢次數(shù)、至少1只pup離巢的時(shí)間等；3、采用高爾基染色的方法分析P9/P21/P120天小鼠海馬錐體區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突／樹(shù)突棘變化；4、采用物體識(shí)別試驗(yàn)、物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P120組小鼠的認(rèn)知能力；同時(shí),采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)及礦場(chǎng)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn),分析P120組小鼠的心理和情緒問(wèn)題;5、采用免疫組化方法分析P120天小鼠GluR1、PSD-95等突觸功能相關(guān)蛋白在海馬區(qū)的表達(dá)和分布情況等。方法1、建立早年生活應(yīng)激動(dòng)物模型：實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6J小鼠,設(shè)應(yīng)激組和同齡對(duì)照組。從出生后第二天(P2)開(kāi)始,改變幼鼠的飼養(yǎng)環(huán)境,持續(xù)一周,建立傷害性應(yīng)激動(dòng)物模型；2、在模型建立之后,于P9、P21(3周齡)和P120(4月齡)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別記錄pups體重,在P2-9天期間,每天相同時(shí)間段監(jiān)測(cè)1小時(shí)內(nèi)母鼠與幼崽的哺乳情況,至少1只幼崽離巢時(shí)間及母鼠離巢的次數(shù)；在P9、P21及P120日清晨(0900),部分應(yīng)激組與同齡對(duì)照組小鼠稱重后頸椎脫臼處死,收集P9日齡小鼠血液,分離所有犧牲掉的小鼠全腦、胸腺及雙側(cè)腎上腺并稱重,其中部分新鮮鼠腦稱重后,迅速切片處理,行后續(xù)高爾基浸漬染色實(shí)驗(yàn),目的是研究上述三個(gè)時(shí)間點(diǎn)海馬CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞的樹(shù)突分支；收集到的血液經(jīng)高速離心后取上清液并冷凍儲(chǔ)存于-80℃冰箱以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)；余應(yīng)激組與同齡對(duì)照組小鼠稱重后,先后用生理鹽水與4%多聚甲醛經(jīng)左心室(主動(dòng)脈弓)灌注固定后分離腦組織存儲(chǔ)與-80℃冰箱；3、采用ELISACORT試劑盒檢測(cè)收集到的P9日齡小鼠血漿皮質(zhì)酮的含量；4、小鼠從第16周開(kāi)始行相關(guān)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn),P120日齡小鼠先完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)再檢測(cè)樹(shù)突棘和突觸相關(guān)蛋白,最后對(duì)行為數(shù)據(jù)和樹(shù)突/突觸數(shù)據(jù)作相關(guān)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。該時(shí)間點(diǎn)行高爾基實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物皆為雄性。小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)需依次完成物體識(shí)別試驗(yàn)、物體位置識(shí)別實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)和礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)后行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)P120日齡組小鼠海馬區(qū)興奮性突觸結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)的支架蛋白,谷氨酸受體等,包括PSD-95, GluR1表達(dá)與分布。結(jié)果1、經(jīng)早期慢性應(yīng)激后的C57BL/6J幼鼠,在P2-P9天期間,1小時(shí)觀察時(shí)間內(nèi),每籠至少1只幼崽離巢時(shí)間明顯高于正常喂養(yǎng)同齡組幼鼠(P0.05),相同觀察時(shí)間內(nèi)母鼠出巢的次數(shù)明顯高于對(duì)照組(P0.05),而1小時(shí)觀察時(shí)間內(nèi),母鼠-幼崽的哺乳時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.1)；經(jīng)早期慢性應(yīng)激刺激后的幼鼠,在P2-9天體重增加明顯低于正常喂養(yǎng)組(P0.05),在P9和P21天,應(yīng)激組幼鼠的胸腺與體重比明顯低于對(duì)照組(P0.05),而雙側(cè)腎上腺與體重比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2, ELISA CORT試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示：應(yīng)激組小鼠P9天皮質(zhì)酮的含量顯著性高于對(duì)照組(P0.05)；3、應(yīng)激組和同齡對(duì)照組新鮮腦片行高爾基浸漬染色后,采用Image J軟件行Sholl分析,結(jié)果顯示：生長(zhǎng)發(fā)育階段,環(huán)境改變影響幼鼠海馬錐體細(xì)胞的發(fā)育,導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突棘延后成熟,而且成熟樹(shù)突棘的數(shù)量減少,特別是成熟樹(shù)突棘的比例降低；4、P120(4月齡)應(yīng)激組小鼠1h后(測(cè)試短期記憶)物體識(shí)別指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P0.05),且24h后(測(cè)試長(zhǎng)期記憶)物體識(shí)別指數(shù)顯著低于對(duì)照組(P0.05),說(shuō)明應(yīng)激組小鼠對(duì)物體認(rèn)知和記憶能力(長(zhǎng)期)低于同齡對(duì)照組小鼠,同樣說(shuō)明早期不良的應(yīng)激環(huán)境可穩(wěn)定導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知、記憶能力減弱至成年；應(yīng)激組糖水偏好分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組(P0.1),說(shuō)明應(yīng)激組小鼠已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)“快感缺失”,但早期的不良應(yīng)激尚未使小鼠發(fā)生抑郁：礦場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,應(yīng)激組比對(duì)照組小鼠更易產(chǎn)生焦慮感,在自由探索問(wèn)題上,應(yīng)激組小鼠顯得過(guò)于“呆滯、膽小”而不敢穿越中央?yún)^(qū),此外,應(yīng)激組小鼠情緒問(wèn)題明顯多于對(duì)照組小鼠；5、P120日齡應(yīng)激組與對(duì)照組小鼠海馬神經(jīng)元錐體細(xì)胞區(qū)的突觸后致密帶(PSD-95)體積減少、GluR1表達(dá)在與記憶功能相關(guān)的樹(shù)突分支節(jié)段上減弱。結(jié)論早期應(yīng)激導(dǎo)致幼鼠的胸腺與體重比明顯低于非應(yīng)激鼠,應(yīng)激小鼠皮質(zhì)酮的含量顯著高于同年齡對(duì)照組；應(yīng)激還影響海馬錐體細(xì)胞的發(fā)育,導(dǎo)致神經(jīng)元樹(shù)突棘延后成熟,而且成熟樹(shù)突棘的數(shù)量減少,特別是成熟樹(shù)突棘的比例降低；早期應(yīng)激損害物體識(shí)別能力,而且機(jī)體認(rèn)知、記憶能力減弱可持續(xù)到成年；另外,應(yīng)激小鼠出現(xiàn)“快感缺失”等情緒方面的問(wèn)題。這些變化可能與應(yīng)激導(dǎo)致的突觸后蛋白的改變相關(guān)�？偠灾�,當(dāng)幼年機(jī)體長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí),通過(guò)內(nèi)分泌軸(HPA-軸)和海馬邊緣結(jié)構(gòu)環(huán)路使海馬內(nèi)增高的應(yīng)激調(diào)節(jié)因子負(fù)性調(diào)節(jié)錐體細(xì)胞上樹(shù)突分子/樹(shù)突棘及其上的突觸發(fā)生改變或丟失,從而影響神經(jīng)纖維通路的正常建立和完善,最終導(dǎo)致認(rèn)知功能損害。
【關(guān)鍵詞】：發(fā)育 應(yīng)激 記憶 海馬
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R338.64
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 縮略詞表10-12
• 第1章 緒論12-15
• 1.1 引言12-15
• 第2章 早期應(yīng)激影響C57鼠發(fā)育短期研究15-30
• 2.1 材料與方法15-24
• 2.2 結(jié)果24-28
• 2.3 結(jié)論28
• 2.4 討論28-30
• 第3章 早期應(yīng)激損害海馬學(xué)習(xí)記憶長(zhǎng)效研究30-51
• 3.1 材料與方法31-40
• 3.2 結(jié)果40-49
• 3.3 結(jié)論49
• 3.4 討論49-51
• 動(dòng)物使用及合格證明51-53
• 致謝53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 綜述58-72
• 綜述一58-63
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 綜述二63-72
• 參考文獻(xiàn)68-72
• 個(gè)人簡(jiǎn)介72-73

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本文編號(hào)：860318